《Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences》：A survey of the Lake Superior cisco complex using integrated morphological and genetic tools reveals a presumed extinct species, Shortnose Cisco (Coregonus reighardi)
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在整个19世纪和20世纪，人为活动导致劳伦森大湖（LGL）中白鲑（ciscoes）的丧失，仅苏必利尔湖保留了相对完整的复合体。1929年，W. Koelz描述了苏必利尔湖的六个白鲑物种：Coregonus artedi、C. hoyi、C. kiyi、C. z
在整个19世纪和20世纪，人为活动导致劳伦森大湖（LGL）中白鲑（ciscoes）的丧失，仅苏必利尔湖保留了相对完整的复合体。1929年，W. Koelz描述了苏必利尔湖的六个白鲑物种：Coregonus artedi、C. hoyi、C. kiyi、C. zenithicus、C. reighardi和C. nigripinnis。其中，C. artedi、C. hoyi和C. kiyi在苏必利尔湖仍保持丰富，C. zenithicus被认为在LGL中除苏必利尔湖外已灭绝，而C. reighardi和C. nigripinnis被认为已灭绝。研究人员呈现的结果重申了C. artedi、C. hoyi和C. kiyi的存在，以及 presumed extinct C. reighardi的存在。分析未确认C. zenithicus和C. nigripinnis的存在。区分C. artedi、C. hoyi、C. kiyi和C. reighardi的主要形态学特征反映了栖息地和营养特化：眼大小、鳃耙长度和鳃耙间距。C. reighardi的发现预计将促进LGL中稀有白鲑的保护和恢复，而研究人员的综合形态学和遗传学方法可为白鲑的进化、多样性和生态学提供见解。
研究背景方面，地球正处于第六次大规模灭绝事件之中，过去两个世纪的人为影响加速了生态系统破坏和动物区系衰退。淡水鱼类占所有脊椎动物物种的四分之一，尽管淡水仅占地球表面的不到1%，但它们在脊椎动物中面临最高的灭绝风险（26%）。北美淡水鱼类的灭绝率保守估计为背景灭绝率的684–877倍。劳伦森大湖（Laurentian Great Lakes，LGL）的鱼类是生物多样性和生态系统功能丧失的典型例子。现代LGL的前身形成于威斯康星冰川退缩后（约15–9 ka），为来自冰川避难所的祖先白鲑提供了广阔的淡水栖息地。20世纪之前，LGL包含一个多样的特有白鲑复合体，主导了鱼类群落，但19世纪和20世纪欧洲定居的人为影响导致白鲑多样性广泛下降。目前，苏必利尔湖是唯一拥有相对完整白鲑复合体的LGL，Coregonus artedi（ART）、C. hoyi（HOY）和C. kiyi（KIY）主导猎物鱼类群落。白鲑在苏必利尔湖食物网中的重要性及其对生态系统功能的重大贡献，引发了在其他LGL（休伦湖、伊利湖和安大略湖）恢复减少和灭绝种群的兴趣。Koelz（1929）描述了苏必利尔湖的六个白鲑形态型作为物种：ART、HOY、KIY、C. zenithicus（ZEN）、C. reighardi dymondi（REI）和C. nigripinnis cyanopterus（NIG）。到20世纪末，REI被认为已灭绝，NIG被认为在LGL中已灭绝，ZEN被认为在LGL中除苏必利尔湖外已灭绝。这些三个物种的区分因Todd和Smith（1980）将苏必利尔湖REI和NIG同义化为ZEN而变得混乱。21世纪对苏必利尔湖同义化分类单元ZEN状况的检查显示，其丰度与1920年代相比大幅减少，但这些鱼类的持续识别一直不确定。自信识别白鲑的挑战源于coregonines（白鲑和whitefishes）的高表型变异，这混淆了物种识别，过去的遗传工具证明不足以解决物种间的差异。这种困境被称为“coregonid问题”（Sv?rdson 1949）和更广泛的“coregonine问题”（Eshenroder et al. 2016），导致将所有白鲑视为一个物种复合体和单一分类单元C. artedi（sensu lato），尽管这种命名惯例未被美国渔业学会-美国鱼类学家和爬行动物学家学会命名委员会采纳。新研究表明，应用新的基因组工具（如限制性位点关联DNA测序（RADseq）、转录组学和全基因组测序（WGS）），ART、HOY和KIY在遗传上是不同的，Bernal et al.（2022）显示这些物种在基因组、形态学和稳定同位素方法上的一致性。在此工作基础上，研究人员的目的是通过形态学和遗传学的综合应用，重新检查Koelz（1929）描述的苏必利尔湖白鲑的当代多样性。研究人员通过以下五个目标实现这一目标：（1）采样苏必利尔湖白鲑的当代多样性。（2）根据Koelz（1929）和Eshenroder et al.（2016）的形态学描述识别白鲑——形态学识别的白鲑将被称为“形态学物种”。（3）对形态学物种的白鲑进行基因分型，并评估遗传识别与形态学识别物种的一致性——与形态学物种一致的遗传识别白鲑将被称为“遗传物种”。（4）通过sensu Koelz（1929）和Eshenroder et al.（2016）的手工测量以及来自数字图像的形态计量特征测量，盘点白鲑的形态多样性。（5）使用多变量方法，识别区分遗传物种白鲑的最信息性形态计量特征，并比较按遗传身份 versus 形态计量相似性的物种分组。研究人员的方法旨在识别苏必利尔湖中形态学和遗传学上不同的白鲑，并阐明反映生态特化并促进白鲑间生态位分离的形态差异。从研究中获得的信息将有助于建立知识库，有利于制定LGL中灭绝或减少的coregonine种群的保护和恢复策略。
研究人员开展的研究方面，从2003–2021年由美国地质调查局、加拿大渔业和海洋部、明尼苏达州自然资源部和大自然保护协会进行的苏必利尔湖鱼类调查的渔获物中选择白鲑。鱼类用底拖网和中层拖网以及底置小网目刺网在苏必利尔湖广泛分布的184个地点采集，深度范围20–200 m。采集时，基于八个视觉评估的分类形态特征进行初步识别，并辅以显示苏必利尔湖白鲑预期特征状态的图解指南。选定的鱼被冷冻并储存在美国地质调查局苏必利尔湖生物站（LSBS）以供后续识别和处理。研究人员使用Cisco Score Card（CSC）进行形态学识别，该评分卡基于Koelz（1929）和Eshenroder et al.（2016）的物种描述，使用12个形态特征（7个主要和5个次要）对六种苏必利尔湖白鲑（ART、HOY、KIY、ZEN、NIG和REI）进行加权评分。主要特征双倍加权，次要特征单倍加权，计算复合分数（范围0–19），最高复合分数表示最佳匹配物种。一致性分数（conformation score）表示与物种描述的最大可能分数的百分比，<6.0为未识别，≥6.0至<7.0为 provisional，≥7.0为 putative。形态学识别后，鱼被拍照以进行形态计量分析，并使用SigmaScan Pro 5.0?软件从数字图像中测量38个形态特征。遗传多样性方面，研究人员使用基于RADseq数据的GT-seq面板（1242个单核苷酸多态性（SNPs）在494个基因座中）对形态学识别的鱼进行基因分型。DNA从冷冻肌肉组织中提取，GT-seq文库制备和测序按照Ackiss et al.（2026）的协议进行。序列数据处理和过滤在R中进行，使用GTscore（v.1.3）对SNPs进行基因分型，去除污染样本，迭代过滤去除不良基因分型基因座和高缺失率个体。遗传多样性和分化通过主成分分析（PCA）和K-means聚类以及STRUCTURE贝叶斯聚类评估。形态计量分析方面，研究人员从成年白鲑及其相关鳃耙的数字图像中测量38个形态特征，使用SigmaScan Pro 5.0?软件创建数据库。统计分析限于Q-score≥0.70的遗传物种，并无缺失形态计量数据的鱼。形态计量特征使用size free morphometric ratios（SFMR）进行大小校正，公式为SFMR?? = MC?? × (STL??/STL??)??/STL??，其中MC??是鱼i的形态计量特征，STL??是鱼i的标准长度，STL??是物种标准长度的几何平均，β是异速生长指数。每个物种对每个形态计量特征估计β。作为对比，研究人员还使用形态计量特征与STL的简单算术比率进行重复分析。统计分析使用PCA探索基于形态计量特征 versus 遗传身份的分组，随后使用二次判别分析（QDA）选择最信息性形态计量特征，使用逐步交叉验证算法选择最佳QDA模型，计算VIF和Pearson相关系数评估多重共线性。然后使用QDA识别的最信息性特征进行PCA，使用k-means++聚类分析识别内在形态计量组，使用平均轮廓法确定最佳组数，使用ANOSIM测试遗传组分离的显著性。研究得出以下结论：在2003–2021年的全湖采样中，初步现场识别六种白鲑物种（ART、HOY、KIY、NIG、REI和ZEN）产生2858条所有生命阶段的鱼，1882条成年鱼用于LSBS实验室的形态学识别。其中1592条被形态学识别到物种（一致性分数≥6.0），1350条有putative识别（一致性分数≥7.0）。形态计量分析从1159条鱼和1596个鳃耙的数字图像中测量。过滤数据集到一致性分数≥6.0和≥7.0的鱼分别产生1090和873条鱼以及1440和1222个鳃耙的完整身体和鳃耙测量。遗传分析选择682条成年鱼以优化空间覆盖和最大化稀有白鲑（NIG、REI和ZEN）的纳入。迭代过滤后，数据集由602条基因分型成年鱼组成，993个SNPs在426个GT-seq基因座中。个体基因型缺失率范围0–0.10（平均0.01）。PCA表明这些形态学识别的白鲑与四个主要遗传簇一致（K=4），三个簇与形态学识别的ART、HOY和KIY一致，第四个簇完全由形态学REI和一小部分形态学ZEN个体组成。STRUCTURE结果与PCA一致。Q-score<0.70的鱼被指定为putative hybrids（n=103）。过滤putative hybrids和重新分配形态学不匹配的白鲑后，剩余499条白鲑与四个遗传物种一致：ART（n=51）、HOY（n=274）、KIY（n=125）、REI（n=49）。四个物种（n=403）的形态学识别与匹配遗传识别高度一致（82.9%–100.0%，总体93.3%），与等价无显著差异。然而，形态学识别的ZEN和NIG（n=96）不对应独特遗传簇，分散在HOY（n=73）、KIY（n=4）和REI（n=19）的遗传簇中。这导致形态学物种（n=376）与遗传物种（n=499）的匹配率降低至75.4%。Putative hybrids在形态学物种间的频率显著不同于预期值，ART、ZEN和NIG有最高的putative hybrid比例（28.2%、24.1%和52.2%），HOY、KIY和REI有最低比例（13.3%、9.8%和3.3%）。去除103个putative hybrids和28条缺失形态计量数据的鱼后，471条个体（四个遗传物种：ART、HOY、KIY和REI）可用于形态计量分析。QDA最佳支持模型包括以下形态计量特征（按重要性顺序）：眶长度（ORB）、第一鳃弓下臂上最接近与上臂拐点的三个鳃耙的平均长度（GRLA）和鳃耙间距（GRS）。该模型稳健，使用70%个体训练时，剩余30%的物种分配准确率为98.7%。VIF值低（ORB最大2.19），Pearson相关系数低，除了ORB ~ GRS（r=0.733）。使用QDA识别的三个最信息性形态计量特征（ORB、GRLA、GRS）的PCA解释了PC分数91.6%的方差。k-means++聚类分析显示四个内在簇为最佳。当形态计量PC分数按遗传物种分组时，97.5%的鱼被正确分配到各自的遗传物种组。ANOSIM测试显示遗传组间显著差异（R=0.8003，p=0.0001）。基于形态计量的内在聚类PC分数与按遗传身份分组的一致性为96.7%–100.0%。作为对比，基于简单算术比率的PCA仅解决42.5%的方差。研究表明，REI在形态学和遗传学上均独特，其发现预计将促进LGL中稀有白鲑的保护和恢复。研究的重要意义在于，综合形态学和遗传学方法可以揭示白鲑的进化、多样性和生态学，为保护 and 恢复策略提供知识库。此外，研究结果验证了Koelz（1929）和Eshenroder et al.（2016）的形态学特征在区分苏必利尔湖白鲑中的效用，并强调了表型变异在形态学识别中的混淆作用。通过“遗传学 informed 形态学”方法，研究人员能够更好地理解与生态功能、生态位分离和物种进化相关的形态差异。
为开展研究用到的主要关键技术方法包括：样本采集（2003–2021年苏必利尔湖全湖调查，底拖网、中层拖网和底置小网目刺网，184个地点，深度20–200 m）；形态学识别（Cisco Score Card，基于12个形态特征加权评分）；形态计量分析（数字图像测量38个形态特征，size free morphometric ratios大小校正，PCA、QDA、k-means++聚类、ANOSIM）；遗传分析（GT-seq面板1242个SNPs在494个基因座中，基因分型、过滤、PCA、K-means聚类、STRUCTURE贝叶斯聚类）。样本队列来源包括美国地质调查局、加拿大渔业和海洋部、明尼苏达州自然资源部和大自然保护协会的调查渔获物。
研究结果方面，1. 苏必利尔湖白鲑的采集和形态学识别：通过全湖采样和CSC方法，研究人员形态学识别了Koelz（1929）描述的六种白鲑（ART、HOY、KIY、NIG、ZEN和REI），其中1592条成年鱼被识别到物种（一致性分数≥6.0），1350条有putative识别（≥7.0）。2. 苏必利尔湖白鲑遗传多样性的解析：PCA和STRUCTURE分析显示四个主要遗传簇（K=4），分别与形态学ART、HOY、KIY和REI一致，ZEN和NIG分散在簇间或中间。3. 形态计量学解析遗传物种：QDA识别ORB、GRLA和GRS为最信息性特征，PCA解释91.6%方差，97.5%鱼正确分配到遗传物种，ANOSIM显示显著分离（R=0.8003，p=0.0001）。内在聚类与遗传身份一致性96.7%–100.0%。4. 白鲑形态变异：HOY显示最大遗传-形态不匹配（36%遗传HOY未匹配形态HOY），但形态HOY与遗传一致性99.4%。ZEN和NIG未形成独特遗传簇，分散在HOY、REI和KIY中。5. Putative hybrids：在形态学物种间分布显著不同，ART、ZEN和NIG比例最高，HOY、KIY和REI最低。6. Coregonus reighardi（REI）的再发现：REI在苏必利尔湖广泛分布，通过最低计数、最短长度和最大间距的鳃耙容易区分，其发现导致命名委员会将其状态从灭绝提升为现存。
讨论部分总结：研究重新检查了苏必利尔湖白鲑的当代多样性，使用CSC形态学识别六种白鲑，基因组分析揭示四个遗传簇（ART、HOY、KIY和REI），形态学与遗传识别总体匹配93.3%。REI的发现构建在Ackiss et al.（2020）和Bernal et al.（2022）的工作基础上，验证了形态学识别方法。HOY显示最大形态变异，ZEN和NIG未形成独特遗传簇，表明表型变异混淆形态学识别。Putative hybrids的不均匀分布可能反映杂交或基因型差异。REI的再发现出乎意料，其广泛分布和独特鳃耙特征（GRLA和GRS）与QDA关键特征对应。研究还讨论了苏必利尔湖白鲑多样性历史、生态 diversif ication 和形态适应的生态功能，强调ORB、GRLA和GRS反映栖息地和营养特化，促进生态位分离。未来研究方向应聚焦于整合遗传、形态、行为、生理和生态差异，以更好地理解白鲑适应独特生态位、促进共存和利用生态系统资源，为保护和恢复策略提供知识库。研究结论部分翻译：研究人员的目标是通过形态学和遗传学的综合应用，重新检查Koelz（1929）描述的苏必利尔湖白鲑的当代多样性。使用CSC，研究人员形态学识别了Koelz（1929）描述的六种白鲑：ART、HOY、KIY、NIG、ZEN和REI。基因组分析揭示四个独特遗传簇，与四个形态学物种（ART、HOY、KIY和REI）密切一致，并指定为遗传物种。REI在形态学和遗传学上均独特的发现构建在Ackiss et al.（2020）和Bernal et al.（2022）的工作基础上，他们显示ART、HOY和KIY在形态学和遗传学上均独特。研究人员对ART、HOY、KIY和REI的形态学识别与遗传身份总体匹配93.3%，验证了形态学识别方法，并确认了Koelz（1929）和Eshenroder et al.（2016）识别的形态学特征在区分苏必利尔湖白鲑中的效用。然而，形态学识别的NIG和ZEN与HOY、KIY和REI遗传簇的一致性显示表型变异可以混淆形态学识别。为解决这个问题，研究人员使用QDA揭示最佳区分四个遗传物种的形态计量特征：ORB、GRLA和GRS。这三个关键特征共同正确分配97.5%个体到各自遗传物种簇。此外，这些特征反映栖息地和营养特化，促进四个白鲑物种间的生态位分离。使用“形态学 informed by 遗传学”方法获得的见解将使研究人员更好地理解与生态功能、生态位分离和物种进化相关的白鲑形态差异。
