《Journal of Biological Chemistry》：C-Terminal Dimerization Enables Assembly of Ebola Virus VP30 Oligomers with transcriptional support activity
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埃博拉病毒（EBOV）VP30是一种多功能磷酸蛋白，对启动病毒转录至关重要。VP30以同源寡聚体形式发挥功能，其寡聚化对转录支持活性必不可少。尽管N端区域（氨基酸（aa）100–105）中的四亮氨酸基序介导寡聚化，但VP30 C端二聚化基序的结构决定因素及功能
埃博拉病毒（EBOV）VP30是一种多功能磷酸蛋白，对启动病毒转录至关重要。VP30以同源寡聚体形式发挥功能，其寡聚化对转录支持活性必不可少。尽管N端区域（氨基酸（aa）100–105）中的四亮氨酸基序介导寡聚化，但VP30 C端二聚化基序的结构决定因素及功能相关性仍研究不足。研究人员利用新高分辨率（1.43 ?）晶体结构和生化方法，鉴定出VP30 C端结构域（CTD）中的142ITLL145残基是VP30二聚化的关键贡献者。这些残基的丙氨酸替换（VP30-CTD142–145A）破坏了CTD二聚化，并由天然质谱、尺寸排阻色谱-多角度光散射和分裂GFP互补实验所证实。值得注意的是，VP30-CTD在微型基因组实验中作为全长VP30的显性负性抑制剂发挥作用，而二聚化缺陷突变体VP30-CTD142–145A则不具有此作用。关键的是，将这些突变引入全长VP30后，在微型基因组实验中完全消除了病毒转录。携带VP30二聚化突变的重组EBOV无法在细胞培养中拯救，表明VP30-CTD二聚化对病毒复制至关重要。总之，这些发现确立了CTD介导的二聚化对VP30的转录支持活性和病毒传播必不可少，将VP30二聚化确定为病毒复制周期中一个先前未被表征的决定因素。重要的是，该二聚化界面在丝状病毒中保守，提示其代表一个广泛保守且潜在可靶向的抗病毒干预弱点。
埃博拉病毒（Ebola virus, EBOV）属于丝状病毒科（Filoviridae）、单股负链RNA病毒目（Mononegavirales），是一种高致病性病毒，平均病死率约为50%。EBOV基因组为非节段负链单股RNA，包含9个开放阅读框，编码7种病毒结构蛋白。病毒RNA被核衣壳包裹，核衣壳由核蛋白（nucleoprotein, NP）、RNA依赖性RNA聚合酶L、聚合酶辅因子VP35、转录激活因子VP30以及VP24组成，其中VP24对核衣壳浓缩和运输至关重要。基质蛋白VP40连接核衣壳与病毒膜，糖蛋白（glycoprotein, GP）插入其中，对病毒入侵和膜融合必不可少。VP30是一种由288个氨基酸（aa）组成的多功能磷酸蛋白，对病毒转录起始必不可少。VP30与NP、聚合酶复合物L-VP35及病毒RNA相互作用。VP30的N端结构域（N-terminal domain, NTD，aa 1–141）包含锌结合位点和RNA结合位点，而C端结构域（C-terminal domain, CTD，aa 142–288）介导与NP的相互作用。VP30以非磷酸化状态启动病毒转录；磷酸化后，VP30依赖的病毒转录下调，而病毒复制增强。因此，VP30的磷酸化充当调控开关，抑制转录同时维持或增强病毒基因组复制。VP30支持病毒转录的确切机制尚未完全阐明，假说认为VP30识别病毒转录起始位点的RNA发夹结构并促进其解旋，从而使VP35-L聚合酶复合物能够启动转录。值得注意的是，VP30的磷酸化状态关键调控该活性：磷酸化的VP30转录支持能力受损，这归因于RNA结合亲和力降低以及被NP隔离。VP30寡聚状态在这些调控过程中的确切作用仍不清楚。
VP30形成同源寡聚体，其NTD内四亮氨酸基序（100LLLL103）的破坏已被证明会损害高级寡聚化并消除其转录支持功能。此外，VP30在病毒粒子中以二聚体和六聚体形式存在。独立地，N端截短的VP30（VP30-CTD，aa 142–272）结晶显示VP30-CTD为二聚体。VP30的C端在丝状病毒中结构高度保守，如马尔堡病毒（Marburg virus, MARV）、雷斯顿病毒（Reston virus）和勐腊病毒（Mengla virus）。然而，CTD二聚化的结构决定因素及其在全长VP30和病毒复制背景下的功能意义仍研究不足，这是理解功能性VP30同源寡聚体形成及其功能的关键空白。本研究中，研究人员证明先前报道的四亮氨酸基序促进高级VP30寡聚体（包括四聚体和六聚体）的形成，而二聚化由CTD内一个独特的界面介导。利用结构、生物信息学、生化、细胞和反向遗传学方法，研究人员鉴定并表征了该CTD二聚化界面，并证明其对VP30寡聚化、病毒转录和病毒传播必不可少。
在技术方法方面，研究人员采用了化学交联结合SDS-PAGE分析VP30寡聚状态；通过悬滴法获得VP30-CTD高分辨率（1.43 ?）晶体结构，利用PHASER进行分子置换，COOT和PHENIX进行精修；采用AlphaFold2（ColabFold）进行丙氨酸突变体的二聚体结构预测；利用尺寸排阻色谱（SEC）、多角度光散射（MALS）和天然质谱（nMS）测定溶液中绝对分子质量；在HEK293和HuH7细胞中开展串联分裂GFP互补实验结合流式细胞术检测细胞内自我相互作用；利用EBOV微型基因组实验评估转录支持活性；通过反向遗传学构建重组EBOV并评估病毒拯救能力。研究所用细胞系为HEK293F、HEK293、HuH7和VeroE6细胞。
研究结果如下：
VP30具有两个不同的寡聚化结构域。研究人员通过化学交联体外翻译的VP30和VP30100-104A发现，VP30以单体、二聚体、四聚体和六聚体形式存在，而VP30100-104A中丙氨酸替换消除了四聚体和六聚体形成，但二聚体组装不受影响。这表明四亮氨酸簇代表特异性参与高级组装的寡聚化界面，并提示VP30二聚化可能由CTD内一个独特界面驱动。
VP30 C端二聚化界面的分析。研究人员通过额外结晶筛选获得衍射至1.43 ?分辨率的晶体（PDB-ID: 32RO），与先前结构（PDB-ID: 2I8B）整体RMSD为0.376 ?（809个原子），B因子略降低，整体折叠未变。利用该结构鉴定候选残基，发现一个原型中Ile142、Thr143、Leu144和Leu145（142ITLL145）与对侧原型中Leu247和Cys251为潜在二聚化贡献者。多序列比对显示Thr143、Leu144（143TL144）和Cys251在丝状病毒中高度保守，而Ile142、Leu145和Leu247不保守。AlphaFold2建模提示142ITLL145丙氨酸替换增加螺旋7与螺旋1之间的间距，超过5 ?截断值，与二聚体界面失稳一致。
142ITLL145残基对VP30-CTD二聚化至关重要。化学交联显示野生型VP30-CTD主要形成二聚体，而VP30-CTD142-145A主要为单体。SEC显示VP30-CTD142-145A比野生型晚约2 mL洗脱，与流体动力学半径减小一致。SEC-MALS显示野生型VP30-CTD分子质量约38 kDa（与二聚体一致），而VP30-CTD142-145A平均约18 kDa（与单体一致）。天然质谱证实野生型VP30-CTD几乎 exclusively 以二聚体存在，而丙氨酸突变体主要形成单体。值得注意的是，仅替换保守残基143TL144的VP30-CTD143/144A在大肠杆菌中表达水平和蛋白稳定性显著降低，无法进行详细生化分析，因此聚焦四重突变体进行二聚化分析，核心残基143TL144的功能重要性随后在哺乳动物细胞中全长VP30背景下评估。
VP30-CTD142-145A在细胞内自我相互作用降低。串联分裂GFP互补实验显示，VP30-CTDβ1–10与VP30-CTDβ11共表达产生强GFP信号，而VP30-CTD142-145Aβ1–10与VP30-CTD142-145Aβ11共表达将GFP阳性细胞比例降至背景水平，表明自我相互作用受损。VP30-CTD142-145A仍保留与NP相互作用的能力，两种方向下GFP阳性比例与相应野生型组合无统计学显著差异，表明二聚化丧失不损害VP30-CTD/NP界面。共聚焦显微镜证实上述结果。
VP30二聚化对转录和复制至关重要。微型基因组竞争实验显示，VP30-CTD共表达导致报告活性剂量依赖性下降，而VP30-CTD142-145A未能抑制转录活性，在HuH7细胞中反而观察到报告活性轻微增加，但在HEK293细胞中该增加不存在，提示细胞类型特异性反应。在微型基因组实验中，142IT143或144LL145丙氨酸替换未显著改变报告活性，而同时突变全部四个残基（VP30142–145A）及保守的143TL144导致报告活性降低>95%。共聚焦显微镜显示，携带142-145A或143/144A丙氨酸替换的VP30突变体被有效招募至NP阳性包涵体，表明微型基因组活性显著降低不太可能源于VP30–NP相互作用受损。这些发现支持VP30二聚化对其转录支持活性必不可少但对VP30–NP相互作用非必需的模型。
携带二聚化缺陷VP30的重组EBOV无法拯救。反向遗传学实验显示，只有野生型重组EBOV质粒可拯救为感染性病毒，而所有突变构建体均未能产生感染性病毒，包括142-145A、143/144A和100/101A突变。基于本研究结果，二聚化缺陷rEBOV拯救失败可由VP30二聚化或高级寡聚化缺失导致VP30介导的转录和复制严重受损来解释。
讨论部分总结：本研究表征了EBOV转录因子VP30二聚化的结构基础和功能相关性。基于结构信息和生物信息学分析，研究人员鉴定VP30-CTD内142ITLL145残基为二聚体界面的候选贡献者。AlphaFold2建模提示这些高度保守残基簇集于预测二聚体界面并稳定原型-原型接触。化学交联、SEC-MALS和天然质谱证明VP30-CTD142-145A同源二聚化显著受损，串联分裂GFP互补实验在哺乳动物细胞中重现该效应。全长VP30中引入丙氨酸替换显示，突变142ITLL145或单独143TL144消除VP30在微型基因组实验中的功能，而突变142IT143或144LL145未显著损害转录，鉴定Thr143和Leu144为VP30功能关键残基。Thr143先前被描述为蛋白磷酸酶1调控的磷酸化位点，需进一步研究Thr143磷酸化是否调控VP30二聚化。VP30-CTD/NP相互作用在分裂GFP实验中无显著差异，共聚焦显微镜证实全长VP30143/144A和VP30142-145A以及VP30-CTD构建体均被有效招募至NP阳性包涵体，表明VP30–NP相互作用保留，转录活性丧失不太可能源于NP结合缺陷，而与VP30二聚化受损一致。促进VP30-NP相互作用的残基Glu197在二聚化突变体中未改变。VP30与其他已知相互作用伙伴VP35和病毒RNA的结合是否依赖其二聚化有待进一步研究。VP30-CTD共表达导致报告活性剂量依赖性下降，与功能性VP30同源寡聚体形成受扰一致；VP30-CTD142-145A未发挥 comparable 抑制效应，表明通过CTD的VP30分子二聚化对功能性VP30复合物形成必不可少。VP30-CTD142-145A与全长VP30共表达导致报告活性剂量依赖性增加，该效应在HuH7细胞中观察到但在HEK293细胞中未观察到，提示潜在细胞类型特异性调控有待进一步研究。重要的是，将142ITLL145或143TL144丙氨酸替换引入rEBOV基因组阻止病毒产生，即使在细胞培养中连续传代后仍无法恢复感染性病毒，表明VP30转录支持活性完全丧失。这些发现确立VP30二聚化为EBOV复制和病毒传播的必要决定因素。先前工作证明N端100LLLL103四亮氨酸基序对VP30寡聚化及其功能必不可少；本研究数据显示N端寡聚化结构域突变仍允许VP30二聚体形成，与先前显示VP30-CTD以同源二聚体存在的工作一致。破坏VP30-CTD二聚化消除VP30转录支持活性的确切机制尚待阐明，一个可能解释是CTD介导的二聚化是高级寡聚体形成的前提，而高级寡聚体对EBOV VP30功能至关重要。研究人员的发现支持VP30二聚体代表高级VP30寡聚化基本组装单元的模型：C端二聚化产生主要构建块——二聚体，两个单体通过其CTD经二聚化基序相互作用形成（1+1）二聚体；N端寡聚化基序介导这些二聚体单元的高级组装，两个二聚体可通过寡聚基序相互作用产生（2+2）四聚体，随后添加第三个二聚体产生（2+2+2）六聚体，其中寡聚基序可能在二聚体亚基之间形成桥接。该层级组装将寡聚基序定位为二聚体-二聚体相互作用的介导者。然而，VP30组装体的精确架构及单体-二聚体-寡聚体转变机制需要进一步结构和生化表征，可能揭示新的抗病毒靶点。Thr143磷酸化可能影响VP30二聚化平衡，提供额外调控层。总之，研究人员鉴定了VP30-CTD内一个保守二聚化热点，并证明破坏该界面消除转录活性并阻止病毒传播。143TL144在丝状病毒（包括MARV和SUDV）中的保守性提示VP30二聚化代表一个广泛保守且潜在可靶向的抗病毒干预弱点。研究结论翻译：这些发现确立CTD介导的二聚化对VP30的转录支持活性和病毒传播必不可少，将VP30二聚化确定为病毒复制周期中一个先前未被表征的决定因素；该二聚化界面在丝状病毒中保守，提示其代表一个广泛保守且潜在可靶向的抗病毒干预弱点。
