细菌作为一种高效的生物机制，可用于生产基于血红蛋白的氧气载体，用于短期治疗

《Journal of Biotechnology》：Bacteria as Efficient Machinery for the Production of Hemoglobin Based Oxygen Carrier for Short Term Therapeutics

　　• 回顾了基于血红蛋白的氧气载体（HBOCs）从供体血液来源和动物来源的血红蛋白到重组生产平台的演变过程。
• 概述了多种异源表达系统用于重组血红蛋白（rHb）的生产，强调了它们的优势、局限性以及提高产量的潜力。
• 比较了包括血红素运输、从头血红素生物合成、AHSP共表达、理性蛋白质工程和生物工艺优化在内的工程策略，以提升rHb的产量和质量。
• 强调了集成菌株工程和可扩展生物工艺在开发高效且经济可行的微生物平台以用于未来HBOC生产方面的潜力。

引言
输血已成为现代医学不可或缺的一部分，对于选择性手术、创伤管理和多种医疗状况都是必需的。这种依赖完全取决于血液供应者的人数（Shah等人，2014年；Timmins等人，2011年）。即使在发展中国家，血液短缺的问题依然存在，并且疾病传播的风险也进一步加剧了这一问题。全球每年大约收集1.125亿单位血液，其中高收入国家贡献了总量的50%（Bhuiyea等人，2022年）。相比之下，低收入和中等收入国家面临着严重的血液短缺问题，其人口中每1000人仅有10人献血（Shah等人，2014年）。与传统血液供应系统相关的另一个挑战是缺乏通用血型，这对于减轻受者的异种免疫反应至关重要（Seo等人，2019年）。
为了解决这些挑战，几十年来人们一直在努力开发人工血液替代品。这些产品可以在实验室中制造，作为人类血液的替代品。这些替代品可能涉及创建无细胞的重组血红蛋白（rHb）作为氧气载体。大规模生产此类蛋白质需要在转基因细菌、酵母、猪、小鼠或植物中进行异源表达（Seo等人，2019年）。定点突变可以进一步增强人类Hb分子的特性。这样的修饰可以用于将Hb定制为基于血红蛋白的氧气载体（HBOC）（Raat等人，2005年）。为了有效地作为理想的HBOC，这些rHb变体应具备适合输血治疗的特定属性。这些基本属性包括高血红素亲和力、抗变性能力、优化的一氧化氮结合和自氧化能力、适度的氧亲和力以及高的表达产量。
然而，在异源宿主中表达脊椎动物血红蛋白（Hbs）是一项具有挑战性的任务。必须解决许多问题，包括球蛋白链的溶解性和等摩尔表达、获得足够的游离血红素、克服HBOCs稳定性差的问题以及提高表达产量（Kettisen和Bulow，2021年）。
rHb的生产成本受可生成的可溶性蛋白数量的影响。当蛋白质需要同时具有溶解性和功能性，并且由多个亚单位组成（如rHb的情况）时，在大肠杆菌中高效生产这种蛋白质尤其具有挑战性。此外，rHb还需要重要的辅因子，如血红素，这可以通过补充或在宿主生物体内增强其生产来实现。
在大肠杆菌中，可溶性rHb的积累受到血红素可用性的限制。因此，提高可溶性rHb产量的策略非常受到关注。目前，医院每单位血液的成本大约在150至300美元之间，这相当于每克Hb约5.00美元。因此，以每克5到10美元的成本生产无热原形式的rHb是一个巨大的挑战（Winslow，2006年）。为了降低生产成本，必须优化能够表达的rHb的数量及其更高的稳定性。这种优化对于在下游处理和纯化过程中保持高产量至关重要，这些过程涉及去除游离卟啉和吸附的脂多糖（LPS）抗原（Shen等人，1997年；Weickert等人，1999年）。实现这一目标需要表达大量稳定的全蛋白，并能够快速有效地纯化且具有极高的产量。本综述讨论了HBOCs的这一方面。

HBOCs的发展：从红细胞提取到重组生产
由于Hb天然的携氧能力，HBOCs已被广泛探索作为输血的替代品。HBOCs要么来源于过时的血液，要么来源于牛血，或者通过在微生物表达系统中生产获得，其中包含无细胞的Hb分子（Alayash，2014年）。早期研究表明，纯化的Hb溶液可以恢复血容量、动脉血压和携氧能力，但伴随着各种不良反应，包括肾衰竭（除了细菌之外，其他用于重组表达Hb的宿主）

随着重组DNA技术的出现，确实可以对Hb进行基因工程改造，从而增强其生物性能并提高生产效率。自20世纪80年代末以来，人们采用了多种表达系统，从细菌（Hoffman等人，1990年）到更高层次的生物，如酵母（S. cerevisiae）（Wagenbach等人，1991年）、昆虫细胞（Groebe等人，1992年）、转基因植物（Dieryck等人，1997年）和动物（大肠杆菌是最常用的异源表达系统）。

对于功能性重组蛋白的经济生产，特别是那些不需要复杂翻译后修饰（如糖基化）的蛋白，大肠杆菌被认为是使用最广泛的表达系统（Chou，2007年；Voulgaridou等人，2013年）。然而，在大肠杆菌中表达蛋白时，主要问题是蛋白质的不正确折叠会导致包涵体的形成（Ramon等人，2014年；Singh等人，2015年）。

HBOCs的功能考虑
红细胞中Hb的氧亲和力受到多种配体的调控，包括质子（H+）、氯离子（Cl-）、二氧化碳（CO2）和2,3-二磷酸甘油酸（2,3-BPG）。在Hb释放氧气的过程中，质子被特定的氨基酸残基吸收，这稳定了低亲和力的T（紧张）状态，并同时促进CO2以碳酸氢盐的形式从组织运输到肺部。这种依赖于pH值的氧结合调控被称为Bohr效应。相反，氧气

在大肠杆菌表达系统中生产的rHBOCs的安全性如何？
尽管细菌系统允许大规模生产rHb，但也会引入高水平的内毒素。这是因为革兰氏阴性细菌细胞壁中的抗原性LPS会与Hb强烈结合，导致最终蛋白质制品受到污染（Kaca等人，1994年；Roth，1996年）。LPS在与Hb结合后会引起炎症反应（Roth等人，1994年）。在输血前去除rHb制品中的内毒素是必要的，因为它们具有强烈的生物活性。

rHb生产的财务考虑
重组人Hb的表达和纯化成本是HBOCs开发的主要瓶颈。在美国，一单位全血的体积约为405至550毫升，含有50.6-99.0克Hb，成本约为500美元（Roback等人，2011年）。目前使用大肠杆菌异源表达rHb的方法可以生产大约0.38-6.6克/升的rHb，成本约为每克2-4美元（Looker等人，1994年；Smith等人，2011年；Weickert等人，1999年）。再加上其他成本……

确定最可行方法的策略比较评估
通过rHb的蛋白质工程可以解决治疗蛋白质的特性，如球蛋白溶解性、血红素结合和结构稳定性，以及功能特性，如氧亲和力、抗一氧化氮（NO）清除能力和抗自氧化能力。一种常见的提高稳定性和血红素结合亲和力的策略是将血红素与蛋白质共价交联。这种现象在天然细胞色素c（Cyt c）、细胞色素P450s和抗坏血酸中都有观察到。

结论与未来展望
代谢工程和合成生物学的进步极大地改善了rHb生产的微生物平台。未来HBOC的发展将依赖于菌株工程、蛋白质设计和可扩展生物工艺的整合。经过工程改造的菌株如Ec-M13增强了血红素的生物合成和结合能力，使得无需外部血红素补充即可实现功能性rHb的可扩展表达。优化的E. coli系统，包括pHUG、pHPEX，促进了血红素的吸收……

缩写
rHb：重组血红蛋白
rHBOCs：基于血红蛋白的氧气载体
ROS：活性氧物种
HoloHb：全血红蛋白
ApoHb：脱铁血红蛋白
EcNE. coli：Nissle 1917菌株
2,3 DPG：2,3-二磷酸甘油酸
AHSP：α-血红素稳定蛋白
Cyt：细胞色素c
Syn Hb：Synechocystis血红蛋白
HUH：血红素利用基因
ApoMb：脱铁肌红蛋白
δ-ALA：δ-氨基乙醛