通过多级代谢工程改造解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），以增强L-酪氨酸的生产

《Journal of Biotechnology》：Multilevel metabolic engineering of Bacillus amyloliquefaciens for enhanced L-tyrosine production

　　

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  在Bacillus amyloliquefaciens中构建了一种不含质粒且不依赖抗生素的L-酪氨酸生产菌株。
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  将tyrA^I309A/E330V和aroA^R27A/K38A基因整合到基因组中，使L-酪氨酸的产量分别增加了57%和35%。
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  通过替换启动子并结合前体供应优化，产量进一步提高了33%。

引言

-酪氨酸是一种具有重要的营养和生理功能的芳香族氨基酸（Song等人，2025年；Zhao等人，2026b年）。研究表明，它有助于提高认知表现，并能缓解与压力、抑郁和焦虑相关的症状（Lin等人，2024年；Shen等人，2025年；Yang等人，2024年；Zhu和Wang，2023年）。由于这些特性，-酪氨酸在食品、饲料和营养保健品中得到广泛应用。对于患有苯丙酮尿症（PKU）的患者来说，-酪氨酸被认为是一种必需氨基酸。这主要是由于负责将-苯丙氨酸转化为-酪氨酸的关键酶缺乏，导致体内-酪氨酸生成不足，因此需要外部补充（Giovannini等人，2007年；Giovannini等人，2012年）。此外，-酪氨酸是多种天然产物的关键前体，包括左旋多巴、p-香豆酸、咖啡酸、salvianic酸A、白藜芦醇和羟基酪醇（Chen等人，2025b年；Ibrahim等人，2024年；Ru等人，2025年；Tian等人，2025年）。这些衍生物具有多种生物活性，如神经保护、抗氧化和抗炎作用，因此在制药领域具有广阔的应用前景（Guo等人，2023年；Han等人，2025年；Lu等人，2025年；Yang等人，2022年）。因此，开发高效、经济且稳定的-酪氨酸生产工艺对于满足不断增长的市场需求和推动健康产业发展具有重要意义。

历史上，-酪氨酸的工业生产主要依赖于蛋白质水解（Lütke-Eversloh等人，2007年；Shi等人，2026年）。然而，这种方法受到原材料供应有限、水解过程中产生污染以及下游纯化步骤复杂的限制（Ping等人，2023年）。虽然酶转化可以在温和条件下实现高度特异的转化，但使用苯酚作为底物可能会破坏细胞膜并使蛋白质变性，从而降低催化剂活性和稳定性（Kim等人，2007年；Xu等人，2019a年）。此外，苯酚具有高度毒性和腐蚀性，对环境和健康构成风险。相比之下，微生物发酵可以利用细胞代谢网络从廉价的碳源从头合成-酪氨酸（Ji等人，2023年；Kim等人，2018年）。这种途径具有较低的原料成本、温和的操作条件以及较小的环境足迹，使其成为-酪氨酸生产的理想选择（Chen等人，2025c年；Shi等人，2026年）。

随着系统代谢工程和合成生物学的快速发展，已经开发出了多种代谢调控策略，包括增强关键酶的表达、阻断竞争性途径、缓解反馈抑制以及改善前体和辅因子的供应（Ping等人，2023年；Shi等人，2026年；Zhao等人，2026a年）。通过精确修改微生物代谢网络，这些策略显著提高了多种宿主中的-酪氨酸产量，例如大肠杆菌（109.2?g/L）、谷氨酸棒杆菌（3.6?g/L）、Corynebacterium crenatum（34.6?g/L）、Bacillus licheniformis（1.2?g/L）和Bacillus amyloliquefaciens（9.39?g/L）（Chen等人，2025c年；Ji等人，2025年；Xu等人，2019b年；Yang等人，2024年）。然而，目前大多数工程菌株仍然依赖基于质粒的表达系统来增强基因表达。这类系统在非选择性条件下存在固有的遗传不稳定性，而且使用抗生素不仅会增加生产成本，还会对大规模发酵带来生物安全风险（Romero-Orejon等人，2026年；Wang等人，2024年）。因此，将关键基因整合到宿主基因组中以构建不含抗生素且遗传稳定的生产菌株已成为优化-酪氨酸生产的重要方向。这一策略已在包括大肠杆菌中的谷氨酸盐、酿酒酵母中的麦角硫因和枯草芽孢杆菌中的麦芽糖酶在内的多种产品的生物合成中显示出优势，进一步证明了基因组整合策略在构建工业生产菌株中的普遍适用性（Chen等人，2025a年；Chu等人，2025年；Yu等人，2025年）。

B. amyloliquefaciens通常被认为是安全的（GRAS），具有较强的蛋白质分泌能力、较高的耐发酵压力能力、成熟的遗传工具箱以及可用的基因组序列。此外，它还具有天然的淀粉水解活性，可以直接利用淀粉基原料，从而有可能降低成本。在我们之前的研究中，B. amyloliquefaciens被用作底盘菌株，通过基于质粒的prephenate脱氢酶和DAHP合成酶的共表达显著提高了-酪氨酸的产量（Ji等人，2025年；Zhao等人，2026a年；Zhao等人，2026b年）。然而，在无抗生素的发酵条件下，重组菌株会出现质粒丢失，导致产量稳定性下降。此外，加强单个代谢途径步骤可能会扰乱代谢平衡，导致中间产物积累和前体供应不足。因此，在基因组水平上平衡代谢途径对于进一步改进至关重要。虽然之前已经报道了染色体整合、启动子替换和前体优化等单独策略，但在B. amyloliquefaciens中系统地整合这些方法以生产-酪氨酸尚未得到系统探索。

因此，在本研究中，采用了一种多层次的代谢工程策略来在基因组水平上增强-酪氨酸的生物合成途径。首先，将编码prephenate脱氢酶和DAHP合成酶的突变基因整合到基因组中，以评估基因拷贝数对-酪氨酸产量的影响。随后，确定了代谢途径的瓶颈，并进行了原位启动子替换，以协调上调限速基因的表达。最后，通过增加磷酸烯醇丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P）的供应来改善前体供应。最终，构建了一种不含质粒且不依赖抗生素的-酪氨酸生产菌株，使其成为工业发酵的有希望的候选者。这项工作还为未来在B. amyloliquefaciens中代谢芳香族氨基酸提供了系统框架。

章节片段

菌株、质粒和培养条件

本研究中使用的细菌菌株、质粒和引物分别列于表1、表S1和表S2中。质粒的构建和扩增使用大肠杆菌 DH5α进行，而B. amyloliquefaciens Z1（野生型菌株）被用作-酪氨酸生产的宿主。所有基因整合和过表达菌株均源自B. amyloliquefaciens Z1。常规培养在含有10?g/L NaCl和10?g/L色氨酸的Luria-Bertani（LB）培养基中进行

tyrA^I309A/E330V拷贝数对-酪氨酸产量的影响

先前的研究表明，过表达突变prephenate脱氢酶基因tyrA^I309A/E330V可以显著提高-酪氨酸的产量（图1A）（Ji等人，2025年）。然而，在没有选择压力的情况下，基于质粒的表达往往在遗传上不稳定，而且抗生素的使用会增加成本并在大规模发酵期间带来生物安全风险（Yao等人，2025年）。为了克服这些限制，我们采用了高表达盒（P43-UTR3-tyrA^I309A/E330V-TamyL）

结论

-酪氨酸是一种具有重大工业价值的芳香族氨基酸。在本研究中，我们采用了一种系统的代谢工程方法，结合基因组整合、原位启动子替换和前体模块优化，对-酪氨酸的生物合成途径进行了改造。首先，将携带prephenate脱氢酶和DAHP合成酶基因的高表达盒整合到Z1菌株的基因组中。tyrA^I309A/E330V基因的三倍拷贝插入增强了-酪氨酸

CRediT作者贡献声明

Dong Zhang：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，获取资金，正式分析，数据管理。Pengfei Jiang：软件开发，数据管理，概念构思。Lanyu Wang：可视化，验证，监督。Jiayu Gu：撰写 – 原始草稿，可视化。Anying Ji：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，正式分析，数据管理，概念构思。Ninghan Feng：资源提供，项目管理，方法学研究，资金获取，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了无锡太湖人才计划，医疗卫生高层次人才团队（项目编号：THRCJH20200406和江苏杰出博士后计划（项目编号：2025ZB095）的财政支持。

Dong Zhang|Pengfei Jiang|Lanyu Wang|Jiayu Gu|Anying Ji|Ninghan Feng