基于无细胞代谢工程的异戊烯醇利用途径的发展及其在多酶级联合成中的应用

《Journal of Biotechnology》：Development of isopentenol utilization pathway based on cell-free metabolic engineering and its application in multienzyme cascades synthesis

　　

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  对异戊烯醇利用途径中的关键酶进行了可溶性表达的筛选。
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  成功构建了一种利用异戊烯醇利用途径（IUP）在体外合成番茄红素的CFME系统。
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  经过优化后，在无细胞系统中20小时内实现了128.04 mg/L的番茄红素滴度。
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  利用IUP在体内验证时，实现了最高的番茄红素滴度为270.0 mg/L。

引言

异戊二烯类化合物，也称为萜类化合物，是一类结构多样且功能多样的天然产物，几乎存在于所有生物体内。植物是这些化合物的主要天然来源，可以合成单萜、二萜、三萜和四萜等多种类型（Degenhardt等人，2009年；Tholl，2015年）。同时，微生物（如细菌和真菌）也产生多种萜类化合物，例如抗生素和色素。这些代谢物具有显著的生物活性，包括抗炎、抗癌、抗氧化和抗菌特性（Vickers等人，2017年）。由于它们的多功能性，异戊二烯类化合物被应用于制药行业（如紫杉二烯、非晶二烯、丹参酮、β-香叶素）、香料和香水行业（如柠檬烯、香叶醇、β-石竹烯、栾油醇），以及作为抗氧化剂（尤其是四萜类化合物番茄红素）（Chen等人，2009年）（图1）。

所有异戊二烯类化合物都是从通用的C₅前体异戊烯二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）生物合成的。在体内，这些前体分子主要通过甲羟戊酸（MVA）途径和2-C-甲基-D-赤藓糖-4-磷酸（MEP）途径生成（Du等人，2023年）。这两种途径都是多酶级联反应，起源于中央碳代谢，涉及超过十七个酶促步骤，并需要多种辅因子来产生IPP和DMAPP（Rico等人，2019年；Ma等人，2022年）。然而，几个关键挑战阻碍了高效的生物合成。首先，漫长的代谢途径、高辅因子需求以及积累的中间代谢物的细胞毒性通常会导致前体严重短缺，从而限制了产物的产量。其次，异戊二烯类化合物的生物合成途径都是复杂的多酶级联反应。将葡萄糖转化为前体IPP和DMAPP需要超过17个酶促步骤，而合成高级衍生物（如单萜）可能需要多达27个步骤。因此，开发针对这些途径中关键“瓶颈”的策略，并简化和完善这些合成途径是至关重要的（Nagegowda等人，2004年；Li等人，2020年）。

为了实现生物合成的简化，可以建立一种使用戊二烯醇作为底物的异戊烯醇利用途径（IUP）。该途径通过两步磷酸化级联反应直接将戊二烯醇（3-甲基-2-丁-1-醇）或异戊烯醇（3-甲基-3-丁-1-醇）转化为通用的萜类前体。具体来说，胆碱激酶（CK）和异戊烯基磷酸激酶（IPK）分别将戊二烯醇磷酸化为异戊烯基单磷酸（IP）和异戊烯醇磷酸化为二甲基烯丙基单磷酸（DMAP）。随后的磷酸化产生了IPP和DMAPP，与天然途径相比，大大减少了酶促步骤和辅因子的需求（Chatzivasileiou等人，2019年）。通过绕过从葡萄糖开始的复杂中央碳代谢，IUP将IPP和DMAPP的合成从原来的6-7步简化为仅2步，有效地消除了涉及20多个酶促反应的传统代谢途径的需要，极大地简化了整个合成过程（图1）。Luo等人通过异源表达AtIPK和ScCK在Yarrowia lipolytica中激活了IUP，使得细胞内IPP/DMAPP的水平提高了15.7倍，番茄红素的最高滴度达到了4.2 mg/L（Luo等人，2020年）。同样，Wang等人将IUP基因AtIPK和ScCK克隆到Escherichia coli BL21(DE3)中的pUC19载体中。在这个系统中，两步磷酸化增强了内源性DMAPP的供应，使萜奎酮A的滴度提高了20.1 mg/L。进一步优化L-色氨酸/戊二烯醇比例和培养条件后，最终将最大产量提高到了106.3 mg/L（Wang等人，2023a）。

为了实现可控和精确的生物合成，无细胞系统提供了一个有前途的替代方案，以克服传统代谢工程中的关键挑战，如菌株开发时间过长、底物利用效率低和产物毒性。无细胞代谢工程（CFME）通过使用含有酶和辅因子混合物的细胞裂解物重新构建级联反应，将酶促过程从体内转移到体外条件下。这个平台促进了底物直接转化为目标产物的过程，并允许在可控和稳定的条件下全面优化反应参数，从而能够在多酶合成中精确调节各种化合物，包括异戊二烯类化合物（如番茄红素、异戊二烯、紫杉二烯、柠檬烯、α-蒎烯）、醇类（如正丁醇）和关键代谢中间体（如甲羟戊酸）（Ward等人，2019年；Karim等人，2020a；Liu等人，2023年；Goh等人，2024年）。开发了一个用于体外原型设计和快速优化生物合成酶的无细胞平台，能够高通量构建和优化多种途径组合。通过模块化混合途径酶，利用Escherichia coli的提取物，在9步异源酶促途径中组装了多种不同的生物合成途径来生产柠檬烯。通过在580种不同的途径条件下筛选150组独特的酶，24小时内的柠檬烯产量从0.2 mM显著增加到4.5 mM（Dudley等人，2020年）。Niu等人开发了一个具有模块化共催化作用的无细胞系统用于生产蒎烯。经过无细胞反应混合物组成的优化后，蒎烯的产量增加了57%，最终滴度达到了1256.31 ± 46.12 mg/L（Niu等人，2020年）。Chen等人利用来自Deinococcus wulumuqiensis R12的香叶基香叶基焦磷酸合成酶（GGPPS）和来自Thermus thermophilus的植烯脱饱和酶（PDS）在无细胞系统中实现了10.74 mg/L的番茄红素滴度；而在基于粗提取物的无细胞系统中实现了14.06 mg/L的番茄红素滴度（Chen等人，2025年）。

为了解决异戊二烯类化合物生物合成中的瓶颈——前体供应不足和多酶协调不良的问题，我们选择了番茄红素作为模型化合物，并实施了结合体外原型设计和体内验证的双重策略。这包括：（i）系统地筛选异戊烯醇利用途径（IUP）中的主要流量控制酶，并通过无细胞代谢工程进行微调；（ii）将体外确定的最佳酶组合和优化参数转移到工程E. coli菌株的构建和迭代优化中。采用的工作流程利用了一个无细胞、酶驱动的平台来规避细胞限制，如代谢干扰和产物毒性。仅使用含有七种催化酶和催化量辅因子的裂解物，就可以从廉价的异戊烯醇中高效合成番茄红素，显著降低了底物成本。随后的体内验证证实，IUP显著提高了番茄红素的滴度，强调了将优化的体外参数转化为活细胞中生产的必要性，从而为微生物工程奠定了坚实的基础。这种综合方法为克服复杂天然产物生物合成中的持续挑战提供了一个通用的框架。

章节片段

菌株、质粒和培养基

本研究中使用的细菌菌株和质粒列在表S1中。E. coli菌株BL21(DE3)和DH5α在LB培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L蛋白胨、10 g/L NaCl）中培养，用于蛋白表达前的种子培养和细胞生长。发酵在2YT培养基（10 g/L酵母提取物、16 g/L蛋白胨、5 g/L NaCl）中进行。根据需要添加氨苄青霉素或卡那霉素以维持质粒的选择。通过加入2%（w/v）琼脂来制备固体培养基。

在IUP途径中构建和验证重组表达质粒

Mtipk（781 bp）、thim（789 bp）、R12ispA（999 bp）、R12idi（993 bp）、MG1655ispA（900 bp）、MG1655idi（549 bp）、crttheB（870 bp）、crtE（990 bp）和crtI（1647 bp）的基因片段通过PCR扩增。凝胶提取后，每个片段与相应的表达质粒一起用限制性内切酶双切割，然后连接以生成用于体外合成系统的重组质粒，分别为pRSFDuet-Mtipk、pETDuet-thim、pET28a-R12ispA、pET22b-R12idi、pET28a-ispA、pET22b-idi等。

讨论

通过IUP途径合成番茄红素由七种关键酶催化：异戊烯基磷酸激酶（IPK）、乙醇激酶、法尼基二磷酸合成酶（IspA）、异戊烯基二磷酸异构酶（IDI）、香叶基香叶基焦磷酸合成酶（GGPPS）和植烯脱饱和酶（PDS）（图1）。对于IUP途径中的关键酶IPK，常用的同源物包括来自A. thaliana（At）、T. acidophilum（Ta）（Liu等人，2016年）、M. jannaschii（Mj）（Chen等人）的酶（Chen等人）。

CRediT作者贡献声明

Hongyu Xing：撰写——原始草稿、方法学、研究。Yanbo Zou：方法学、研究、数据管理。Yuhan Yuan：验证、研究、数据管理。Qiuyi Shen：方法学、研究。Fengzhi Xu：方法学、研究。Yuting Tan：验证、研究。Xueting Lu：撰写——审阅与编辑、数据管理。Mengjuan Sun：撰写——审阅与编辑、方法学、研究、概念化。Xian Xu：撰写——审阅与编辑、项目管理。

资助

本研究得到了中国国家自然科学基金（21978136）和江苏省自然科学基金（BK20211268）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些利益或关系可能会影响本文所述的工作。

Hongyu Xing|Yanbo Zou|Yuhan Yuan|Qiuyi Shen|Fengzhi Xu|Yuting Tan|Xueting Lu|Mengjuan Sun|Xian Xu