骨转移研究中的多尺度成像与分析模型：从分子机制到患者来源模型的整合视角

《Journal of Bone Oncology》：Investigating bone metastases: imaging and analytics perspectives

　　

骨是乳腺癌和前列腺癌最常见的远处转移部位，在晚期患者中累及比例可达70%，同时也是肺癌、肾癌和甲状腺恶性肿瘤的常见转移部位。由此产生的骨骼并发症，如病理性骨折、高钙血症、脊髓压迫和难以忍受的疼痛，严重损害患者的生活质量。一旦形成，骨转移基本无法治愈。目前的治疗选择主要集中于症状控制和预防进一步的骨骼相关事件，而非消除疾病。尽管骨转移在临床上十分常见且经过数十年深入研究，骨定植的确切机制仍未被完全阐明。这一空白部分源于含有肿瘤细胞的患者来源骨活检材料稀缺，限制了对人类疾病的直接研究，也使临床前模型成为研究骨转移机制不可或缺的工具。这些实验模型必须能够重现该疾病的生物学复杂性。 骨转移通过一个多因素、多步骤的级联过程发生，该过程在转移灶可被临床检测到之前很久便已启动。肿瘤细胞从原发部位脱落，侵袭周围细胞外基质（ECM），内渗进入脉管系统，并以循环肿瘤细胞（CTC）的形式进入血流。仅有小部分CTC成功到达并定植于骨髓。存活并到达骨髓的肿瘤细胞可作为播散性肿瘤细胞（DTC）持续存在，在数年至数十年内不被察觉，最终发展为明显的转移性疾病。在整个级联过程中，原发肿瘤微环境和骨微环境均发挥积极且不可或缺的作用，涵盖对远处部位的早期预适应、转移前龛的形成以及骨骼疾病的进展。剖析各个步骤和生物学参与者，需要能够在适当生物学尺度和分辨率下捕捉每一组分的实验系统。 过去数十年间，已出现多种用于研究骨转移的临床前方法。体外和组织工程模型能够在三维条件下对肿瘤-骨相互作用进行受控探究。小鼠异种移植模型在活体生物中重现多步骤转移级联，仍是该领域最广泛使用的平台。斑马鱼幼体异种移植提供了一种互补系统，其幼体光学透明性使单个肿瘤细胞与造血龛相互作用的实时高分辨率成像成为可能。先进成像技术进一步拓展了这些系统可观察的范围，从单细胞动力学到骨基质组成的纳米级分析。 上述每种方法都针对骨转移生物学的不同维度，且作为旨在接近生理条件的实验系统，各自具有固有优势和局限性。因此，一种系统的、以问题为导向的视角——不是从可用方法出发，而是从待回答的精确生物学问题出发，反向确定哪种实验系统实际具备解决该问题的能力——对于取得有意义的进展至关重要。没有单一模型能够完全复制其所要代表的生物学复杂性，但每个模型在应用于正确问题并在了解其能与不能捕捉之内容的前提下加以解读时，都能提供信息。本综述考察这些互补方法：各自贡献什么、局限何在，以及如何组合使用。 肿瘤细胞播散：循环肿瘤细胞是转移形成的主要驱动因素，在肿瘤发生早期即从原发肿瘤脱落并进入血流。肿瘤细胞并非偶然进入循环；上皮-间质转化（EMT）似乎是促进其释放的生物学程序之一，尽管其完成并非先决条件，因为CTC常保留EpCAM和角蛋白等上皮标志物。细胞可塑性和癌症干性也被证明可使某些肿瘤细胞易于形成转移。 当肿瘤细胞从原发肿瘤迁移至骨时，会遇到多种环境。为适应这些环境，肿瘤细胞通过肌动蛋白细胞骨架的动态重塑改变其生物物理和形态学特性。在此背景下，EMT诱导肌动蛋白细胞骨架和细胞黏附的改变，从而增强肿瘤细胞的迁移能力。例如，E-钙黏蛋白在上皮细胞中高表达，部分通过其与F-actin的间接相互作用实现强细胞间相互作用。EMT发生后，E-钙黏蛋白下调，导致维持细胞-细胞黏附所需的环周F-actin束破坏。此外，EMT增加波形蛋白表达，后者与F-actin和微管形成网络，促进细胞运动并因此增强侵袭性。 肿瘤细胞播散过程需要侵袭周围ECM，包括基底膜和结缔组织，这由肿瘤细胞内在机制、基质相互作用和原发肿瘤部位的基质重塑驱动。肿瘤细胞侵袭性通过降解ECM的蛋白酶上调而进一步增强，而基质细胞通过促进细胞黏附丧失和上皮极性丧失、促进迁移侵袭表型的获得，积极参与该过程。 当肿瘤细胞侵袭周围组织时，主要通过两种模式迁移：阿米巴样和间质样迁移。根据环境不同，癌细胞可在间质样和阿米巴样迁移之间动态切换，突显了一种促进侵袭性细胞播散的塑性机制。呈阿米巴样运动的细胞以圆形形态、对周围结构低黏附的方式作为单细胞迁移，通常对ECM造成很少损伤。阿米巴样迁移涉及在细胞前缘形成前导泡，产生压力使突起形成。阿米巴样迁移需要生成线性F-actin束以支持该起泡和膜突起；肌动蛋白分支受到抑制。 相反，间质样迁移需要强整合素介导的ECM黏附，涉及α5β1等整合素通过黏着斑和纤维黏附与ECM配体结合。与阿米巴样迁移不同，间质样迁移涉及在细胞前缘形成含分支肌动蛋白网络的片状伪足以形成突起。片状伪足通过黏着斑处的整合素附着于ECM；整合素又通过talin和vinculin与肌动蛋白细胞骨架连接，从而产生向前运动的牵引力。以协调方式，肌球蛋白-II介导的肌动蛋白应力纤维收缩发生在后缘，促进黏着斑解聚并驱动向前运动。 原发肿瘤部位新血管形成对肿瘤细胞播散至关重要。生长中肿瘤内的代谢应激改变促血管生成和抗血管生成信号之间的平衡，促进内皮细胞和成纤维细胞募集以及从周围基质形成新微血管。除满足增殖肿瘤细胞增加的代谢需求外，这种新生血管化还支持局部浸润并为肿瘤细胞进入循环提供途径。到达血管后，肿瘤细胞必须内渗才能转移至远处器官。内渗涉及动态细胞变化，包括细胞-细胞黏附降低、细胞骨架重排、基质重塑和内皮间隙增宽，共同促进间质样肿瘤细胞进入脉管系统或淋巴系统。 在内渗过程中，侵袭伪足形成和细胞硬化是关键F-actin驱动的步骤。侵袭伪足是长突起，使癌细胞能够开始穿过内皮细胞屏障进入血管腔。乳腺癌转移对Mena侵袭性异构体（Mena-INV）的需求证明了细胞骨架在该过程中的作用。Mena-INV通过抑制蛋白酪氨酸磷酸酶1B稳定cortactin-Tyr142磷酸化，从而促进Arp2/3激活并稳定侵袭伪足。此外，EMT诱导的波形蛋白表达增加增强细胞骨架完整性、增加细胞硬度，并提高肿瘤细胞穿过内皮细胞屏障迁移的能力。该屏障进一步被肿瘤细胞与内皮细胞之间的相互作用破坏，削弱内皮细胞连接。 CTC稀少，在多数患者中通常不超过每10 mL血液10个细胞，单细胞半衰期短于30 min。由于血流条件对上皮性肿瘤细胞恶劣，大多数被免疫监视清除或发生凋亡，可能经历强选择过程。事实上，估计仅0.02–0.1%存活转运并成功归巢至次级器官。在循环中存活的CTC可能代表由血流选择压力塑造的生物学选择亚群。它们表现出上皮-间质可塑性、黏附分子表达改变和AKT依赖性存活机制，这些直接关系到其归巢和定植远处器官的能力。CTC还可通过失巢凋亡抵抗进一步逃逸凋亡，在缺乏正常细胞-基质接触的情况下过表达激活促存活信号通路的表面受体。 进入循环后，CTC必须适应恶劣物理环境，暴露于流体剪切应力和血流动态压力。为克服这些力并抵抗循环中的破坏，它们重组F-actin丝以增加皮层硬度。皮层硬度指细胞皮层的机械刚性，由质膜和下方皮层肌动球蛋白网络形成。这种皮层硬度增加通过RhoA和肌动球蛋白依赖性机制发生。此外，整合素介导的肿瘤细胞同型聚集以及与血小板等其他组分的异型相互作用进一步增强细胞存活。 CTC黏附于骨髓内皮并外渗进入骨髓腔，该过程由趋化因子信号、整合素相互作用和骨微环境独特细胞组成促进。决定CTC转移部位的主要因素是血流和分子信号。调控CTC归巢至骨的主要通路之一是CXCL12-CXCR4趋化因子轴信号。CXCL12由骨内多种细胞产生，包括内皮细胞、成骨细胞和骨髓基质细胞。当肿瘤细胞进入骨血管时，微环境中的CXCL12激活小G蛋白偶联的CXCR4受体，进而激活细胞表面整合素，使CTC能够黏附于骨髓内皮。 CXCL12还刺激CTC趋化进入骨髓。CTC利用肌动球蛋白介导的细胞骨架收缩性以及如内渗时一样的侵袭伪足形成，穿过内皮细胞屏障并克服空间限制。F-actin动态重排在过程中的必要性通过F-actin结合蛋白SWAP70缺陷肿瘤细胞的研究得到突显，该蛋白最近被证明是肿瘤细胞有效外渗和形成骨髓转移所必需的。 上述所有特征和过程都需要肌动蛋白细胞骨架的高度动态重排。因此，使肿瘤细胞能够迁移、侵袭并因此转移的F-actin重排已被指定为癌症的标志。在肿瘤细胞中活跃并对迁移和侵袭所需各种肌动蛋白依赖性结构形成有重要贡献的蛋白，现已成为预防和/或治疗的潜在靶点。肿瘤细胞劫持并利用此类蛋白为己所用，导致特别具有运动性和侵袭性的肿瘤细胞被选择。例如，F-actin结合蛋白fascin被证明促进肿瘤细胞侵袭。 调控F-actin结构的蛋白之一是SWAP70，它可在细胞膜处成束F-actin。它已被证明影响免疫细胞的迁移和黏附。为研究SWAP70在转移中的作用，使用4 T1乳腺癌细胞系作为模型。将4 T1细胞原位注射到BALB/c小鼠乳腺脂肪垫中。分析肿瘤生长及向骨和肺的转移。发现SWAP70缺陷的4 T1细胞与对照细胞相比形成更少的骨和肺转移。此外，注射SWAP70缺陷细胞的小鼠骨病变严重程度降低。SWAP70被证明促进癌细胞的迁移、侵袭和黏附，并影响其皮层硬度，这与迁移行为一起可影响转移性骨趋向性。尽管SWAP70本身是一种细胞内蛋白，但其在肌动蛋白依赖性转移过程中的作用可能有助于识别可进行药理学靶向的细胞骨架信号通路，包括由Rho GTP酶及其下游效应器调控的通路。 一旦在骨髓中建立，这些细胞被称为播散性肿瘤细胞（DTC），其后续行为由局部微环境塑造。一些发生凋亡或免疫介导清除，另一些重新进入循环、以休眠状态持续存在或增殖，最终通过局部侵袭和血管生成驱动癌症诱导的骨病。 肿瘤细胞并非随机播散；相反，特定器官提供特别允许其生长的微环境，这一概念由Paget于1889年首次描述为“种子与土壤”关系。骨代表这样一种优先环境，有利于DTC的停滞、存活和生长。并非所有癌症显示相同的骨趋向性：乳腺癌和前列腺癌定植骨骼的频率远高于子宫内膜癌、尿路上皮癌或头颈癌。早在肿瘤细胞实际到达骨之前，越来越多证据表明原发肿瘤可远程准备局部微环境，创建支持性转移前龛以促进后续肿瘤细胞定植。尽管乳腺癌和前列腺癌显著骨趋向性的分子基础尚未完全了解，但已在骨骼定植不同阶段涉及若干共享机制。这些包括CXCR4介导的向CXCL12归巢、αvβ3整合素依赖性骨ECM组分相互作用，以及骨拟态，即肿瘤细胞获得支持其在骨骼环境中存活和生长的成骨细胞样分子特征。虽然这些机制并非乳腺癌和前列腺癌独有，但其综合贡献可能有助于解释这些肿瘤相比骨趋向性较低的恶性肿瘤具有更大定植骨倾向。 骨微环境作为转移龛：肿瘤细胞归巢至骨可能部分由机械因素驱动。红骨髓中的窦状毛细血管具有变化的通过量、宽内皮间隙和薄结缔组织包膜，易于被循环肿瘤细胞透过，而局部慢血流可能进一步促进其附着于骨内膜表面。骨髓包括异质性细胞微环境，由骨髓基质细胞以及成骨细胞、破骨细胞、内皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和造血干/祖细胞组成。这些组成细胞不是被动旁观者，而是通过营养因子、细胞因子和趋化因子复杂网络促进或抑制转移进展的积极参与者。矿化骨基质进一步促进这种允许性，作为生长因子储库，包括TGF-β、IGF-1、成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白，在破骨细胞介导的吸收后释放并在骨髓中局部可供肿瘤细胞利用。 到达骨髓后，肿瘤细胞必须采取存活策略以持续存在和扩增。成骨细胞谱系来源因子，包括纤连蛋白，已被证明通过与特定骨髓基质亚群相互作用调节乳腺癌细胞定植。DTC必须与造血干细胞竞争龛占据，其与成骨细胞谱系细胞和骨髓基质群体的初始相互作用决定其将增殖、进入休眠还是发生凋亡。相当比例的DTC进入持续静息状态，保持存活但不增殖数年至数十年。因此，休眠是骨转移实验建模最具挑战性的方面之一，因为休眠细胞稀少、不产生可检测病变，且其生物学特性与大多数实验系统所校准的活跃增殖细胞显著不同。龛内稳定微血管与长期肿瘤细胞休眠相关，而血管出芽与休眠细胞再激活和加速转移性生长相关。 骨髓还含有大量脂肪细胞群体，即骨髓脂肪组织（BMAT），随衰老增加，并日益被认为是转移龛的活跃组分而非惰性填充组织。骨髓脂肪细胞可通过脂质转移和旁分泌信号影响肿瘤细胞迁移、存活和代谢适应，而富含脂肪细胞的条件与转移性前列腺癌模型中增强的缺氧相关信号和氧非依赖性HIF-1α激活相关。 一旦肿瘤细胞成功定植骨，其存活和选择性生长越来越依赖局部微环境，它们通过劫持龛、调节血管和基质信号以及逃避免疫监视积极重塑该微环境。 肿瘤-骨串扰与疾病进展：骨转移大致分为成骨性，由过度骨形成驱动，或溶骨性，以病理性骨破坏为标志。虽然乳腺癌和前列腺癌均常转移至骨，但倾向于产生不同病变类型。前列腺癌骨转移主要为成骨性，尽管溶骨性和混合性表现也发生。相反，乳腺癌更常产生溶骨性病变，尽管成骨性和混合性形式同样可见。肺癌代表另一种高骨转移频率的癌症类型。这些病变主要为溶骨性，并可与破骨性骨吸收标志物升高相关。破骨细胞激活导致骨吸收增加和骨质疏松，大大增加患者病理性骨折风险和发病率。 肿瘤细胞分泌一系列蛋白作用于驻留骨髓细胞，触发破骨细胞和成骨细胞的募集和激活。当骨被吸收时，矿化基质中嵌入的生长因子和钙离子被释放，增强肿瘤细胞增殖以及溶骨性和成骨性介质的分泌。这建立了一种自我放大的相互作用，称为恶性循环，使骨破坏和肿瘤生长持续。 癌细胞对破骨细胞分化和激活可直接由白细胞介素-11调控，或间接通过RANKL/OPG通路调控。缺氧骨环境还激活骨驻留细胞中的HIF信号，促进肿瘤细胞归巢至骨和破骨细胞生成。反过来，新形成的破骨细胞为骨转移提供有利环境。 因此，理解破骨细胞分化和功能对于开发破骨细胞活性、病理性骨吸收和转移进展的潜在抑制剂很重要。一些化合物，如唑来膦酸和硼替佐米，已在癌症患者中使用，因为它们已知抑制破骨细胞生成和骨吸收。然而，新的潜在抑制剂和靶点的识别正在进行中。 破骨细胞骨吸收的主要前提之一是形成带样F-actin结构（F-actin环），即所谓的封闭区。该结构创建吸收腔以分泌质子和组织蛋白酶K等蛋白水解酶，参与骨基质降解。F-actin环从称为podosome的黏附性富含肌动蛋白结构演变而来，podosome可在微管帮助下聚集并组织成吸收区的podosome带。然而，该过程细节仍知之甚少。尽管如此，已知调控肌动蛋白动态的蛋白在该过程中起重要作用。例如，肌动蛋白成核因子如WASp和ARP2/3已被证明对F-actin环形成至关重要。 Rac1和Rac2（已知的肌动蛋白细胞骨架调控因子）双缺失导致小鼠严重骨质疏松。F-actin切割蛋白cofilin已被证明参与podosome带组装。另一个据报道对F-actin环形成和破骨细胞吸收至关重要的蛋白是F-actin成束蛋白SWAP-70。该蛋白具有一个Pleckstrin同源（PH）结构域，促进其与PIP3脂质的膜结合，以及一个二聚化结构域，其后是其C末端最末端的肌动蛋白结合位点。转位至细胞膜后，SWAP-70二聚化并暴露其F-actin结合结构域，导致F-actin结合和成束。缺乏含二聚化区和F-actin结合位点C末端部分的SWAP-70未能挽救破骨细胞吸收试验中的SWAP-70 KO表型。 尽管骨细胞是骨中数量最多的细胞类型，但其在骨转移中的作用仍知之甚少。骨细胞可表达趋化因子，包括CXCL12；然而，骨细胞来源趋化因子对肿瘤细胞归巢和骨趋向性的贡献仍不清楚。作为机械感觉细胞，骨细胞检测并响应生长肿瘤病变施加的物理力，这一过程促进肿瘤生长和破骨细胞形成。在免疫 competent 的骨趋向性癌症小鼠模型中已记录皮质骨基质内直接的肿瘤细胞-骨细胞接触，其中观察到浸润肿瘤细胞靠近空陷窝和嵌入的骨细胞（图1）。 因此，骨转移级联涵盖一系列涉及细胞参与者（包括肿瘤细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、内皮细胞和免疫细胞）以及非细胞因素（如基质结合生长因子和机械信号）的独特生物学事件，所有这些共同塑造允许恶性进展的微环境。该龛内的癌细胞响应局部线索经历持续的遗传和表型适应，进一步加剧实验建模的挑战。没有单一系统能够完全重现这种复杂性；相反，每种实验方法捕捉相互作用的特定子集，其价值在于有意匹配手头的生物学问题，这一原则指导以下各节的结构。 骨转移体外模型：骨转移体外模型涵盖从简单单培养到多细胞共培养系统、从二维（2D）单层培养到三维（3D）组织工程和支架构建体的广泛复杂性谱。表1总结了本综述涵盖的体外和体内系统，列出各自捕捉的骨转移方面及其主要优势和局限性。 2D细胞培养模型：癌细胞系2D单层培养仍是骨转移研究中最常用的体外平台之一，因为它们提供了数十年来维持其使用的实际优势。它们为研究细胞和分子机制及药物效应提供了宝贵系统，不受原发组织有限可用性或细胞数量不足的限制。癌细胞系为生成异种移植和原位动物模型提供可再生和可扩展的实验材料来源。 已建立的细胞系如MDA-MB-231及其骨趋向亚克隆（MDA-MB-231 Bone/MDA-231BO，通过从骨转移灶回收的细胞反复体内外传代建立）已被用于研究骨骼转移机制，特别是迁移模式。雌激素受体阳性MCF-7系作为相对低侵袭性 luminal 模型。前列腺癌细胞系包括PC-3（源自骨转移）、LNCaP（源自人前列腺腺癌转移灶）及其雄激素非依赖性、骨和淋巴结转移亚系C4–2同样被使用。在小鼠模型中，鼠乳腺癌系4 T1也用于研究向骨和肺的转移。 尽管CTC在驱动转移形成中起核心作用，绝大多数实验研究依赖源自原发肿瘤或实体转移灶的细胞系。结果，转移级联的许多步骤仍未得到充分研究，不是因为被认为不重要，而是因为研究它们的实验工具直到最近才缺乏。CTC代表转移级联的细胞中介，只有进入循环的小亚群具备成功外渗、存活和定植远处部位所需的特征。这些转移 competent CTC携带由其循环存活塑造的表型和分子特征：独特的细胞骨架结构、改变的表面标志物谱和与骨归巢直接相关的信号适应。这些特征未被实体瘤来源细胞系捕捉。 CTC-ITB-01建立自一名晚期转移性乳腺癌女性患者，其表现为每毫升血液1547个CTC，并在骨、淋巴结、脾、肝和阴道有转移。该细胞系按先前描述建立和表征，符合伦理批准和患者知情同意。拷贝数变异谱显示CTC-ITB-01与患者血液中分离时存在的CTC高度一致，提供直接证据表明该系反映原位CTC群体而非原发肿瘤。在导管内患者来源异种移植（PDX）小鼠模型中，CTC-ITB-01形成原发肿瘤并自发转移至多个器官，骨显示最高离体生物发光信号，与患者临床疾病分布一致。因此，CTC-ITB-01不取代已建立模型，而是通过引入其生物学由明显骨骼疾病患者活跃转移播散塑造的细胞群体来补充它们。其他CTC来源细胞系也已从乳腺癌患者建立，如CTC-3，其显示比MCF-7细胞更强的增殖和侵袭能力以及更大的CD44+/CD24?干细胞样亚群。 除肿瘤细胞模型外，2D系统也用于研究促进转移进展的骨驻留细胞。识别和表征调节F-actin动态且为F-actin环形成、破骨细胞功能和吸收所需的蛋白，对潜在医学应用特别有意义。从鼠和人前体细胞体外生成破骨细胞的试验，以及评估破骨细胞功能和细胞骨架组织的试验，对这些研究特别有价值。此外，体外生成的破骨细胞与癌细胞的共培养试验可提供对骨转移机制的新见解。 体外产生破骨细胞培养有不同方法。RAW 264.7鼠单核细胞系已被证明在无血清或含血清培养基中在重组RANKL存在下分化为功能性破骨细胞。原代骨髓来源鼠破骨细胞可从暴露于L929-M-CSF条件培养基或人重组M-CSF和人可溶性RANKL的单核细胞生成。或者，骨髓来源破骨细胞可通过在M-CSF存在下将单核细胞接种于成骨细胞来源基质上或与成骨细胞共培养获得。人破骨细胞培养也可从外周血单核细胞体外建立，通过塑料黏附富集单核细胞或使用CD14结合珠纯化单核细胞，随后在含重组人M-CSF和RANKL的破骨细胞分化培养基中培养。 用破骨细胞培养可进行若干试验以表征其结构和功能。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色传统上用于识别破骨细胞。或者，用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和荧光偶联鬼笔环肽（标记F-actin）染色可用于可视化破骨细胞，其表现为由其单核前体融合产生的巨多核细胞（图2A）。 该方法可与免疫荧光结合以可视化破骨细胞中目标蛋白的定位。为实时追踪肌动蛋白细胞骨架动态、F-actin带形成和podosome动力学，破骨细胞前体可转导Actin-绿色荧光蛋白（GFP）并通过共聚焦视频显微镜或其他先进荧光技术如荧光漂白后恢复（FRAP）分析。此外，肌动蛋白环再形成试验可应用于研究破骨细胞内细胞骨架驱动的重组。破骨细胞功能试验的重要一项是骨基质吸收。第一步，通过在成骨分化培养基中培养Sa-OS-2细胞获得成骨细胞来源基质。第二步，去除成骨细胞并将破骨细胞接种于产生的基质上。可在感兴趣时间点测定吸收活性。成骨细胞来源基质的吸收用Von Kossa染色可视化，其标记钙沉积，而破骨细胞产生的吸收坑可用图像分析定量（图2B）。 破骨细胞体外试验是研究破骨细胞分化、功能和肌动蛋白动态以及识别参与这些过程的蛋白的宝贵技术。 尽管对机制研究和高通量筛选有用，2D模型具有根本局限性，特别是当问题具体涉及骨转移时。标准单层培养不捕捉癌细胞与肿瘤周围环境之间复杂的物理化学相互作用，3D骨组织固有的空间因素如基质深度、细胞连通性和细胞-基质串扰无法在平面上复制。此外，癌细胞的体内生长在增殖率和基因表达方面与单层培养显著不同。已建立细胞系在长期培养中经历转录组变化，越来越反映培养适应而非原发肿瘤特性，尽管保留原始驱动突变。ECM配体在2D格式中的呈现对细胞施加人工几何约束，以不反映天然组织背景的方式影响信号、增殖和迁移。这限制了对于确定癌细胞在骨微环境中功能至关重要的3D空间背景。转移细胞以降低的基质黏附为特征，无法在平坦培养表面形成紧密黏着斑，因此难以在标准单层条件下维持。结果，从2D系统产生的数据可能具有有限生理相关性并难以转化为临床有意义结论。 三维模型：骨是动态重塑器官，其结构和功能依赖于成骨细胞、破骨细胞、内皮细胞和造血细胞群体之间的3D相互作用。细胞-细胞和细胞-基质相互作用在肿瘤形态发生和癌症转移中起核心作用。过去数十年，3D培养系统已成为单层培养还原论和动物模型系统复杂性之间的中间体，更接近细胞天然环境，即细胞被ECM和多样细胞群体包围。这些系统为细胞提供类似体内肿瘤的形态和极性。这使得能够更生理相关地研究骨转移，包括肿瘤细胞迁移、侵袭、龛特异性微环境，同时保持可重复性和细胞成像能力。 球状体：癌细胞球状体，也称为多细胞肿瘤球状体，是通过单细胞悬液自组装或强制聚集形成的无支架3D细胞聚集体。它们可以是同型的，由一种细胞类型组成，或更复杂的异型结构，由两种或更多细胞类型共培养产生。球状体是研究不同肿瘤类型最广泛使用和适应性最强的3D培养模型之一。与单层培养相比，它们更接近地重现选定的体内特征，如空间结构、代谢活性、机械特性、生长行为以及对化疗和内分泌治疗的响应性。其组织良好的分层结构可类似无血管肿瘤组织结构。它们包括外层增殖细胞区、暴露于有限营养和氧可用性的内层静息细胞区，以及取决于球状体大小和培养条件的中央坏死核心。球状体相比更复杂3D骨转移模型提供实际优势，包括相对简单的生成和维护、与成像和定量表征的兼容性、高可重复性、实验可控性和低成本。球状体形成可通过几种方法实现，包括低黏附板、悬浮培养和悬滴法，每种均促进细胞聚集而非附着于固体表面。 作为无支架系统，它们不需要生物材料，减少实验混杂因素并促进细胞响应的解释。3D结构具有生长细胞因子和代谢需求的不均匀分布、紧密的细胞-细胞和细胞-基质接触、可溶性因子的非均匀梯度、缺氧和慢周期区域以及酸性细胞外环境，比单层培养更接近体内肿瘤微环境的复杂性。这些特征使球状体适合重现实体瘤的选定特征并分析转移相关过程，包括癌细胞脱离和向迁移性间质样状态转变、黏附介导的增殖和存活，以及与肿瘤再生长和治疗抵抗相关的缺氧相关癌症干细胞样群体。整合各种基质细胞类型能够研究肿瘤-基质相互作用和信号过程如何影响肿瘤进展、血管生成、侵袭性和治疗响应。胶原-藻酸盐球状体模型中的双光子显微镜已可视化癌细胞朝向表达CXCL12的基质细胞以太阳爆发模式定向和迁移，揭示CXCR4-CXCL12结合如何促进癌细胞迁移和侵袭。因此，球状体是研究肿瘤进展选定方面（包括肿瘤细胞侵袭、迁移和与微环境相互作用）的多功能3D模型。 在骨转移背景下，球状体共培养系统已被用于研究肿瘤-基质相互作用、侵袭和迁移、药物响应以及骨相关细胞群体存在下的癌细胞行为。掺入乳腺癌或前列腺癌细胞与人骨髓基质细胞的骨转移球状体使共聚焦成像和球状体内细胞动态定量分析成为可能。这揭示了球状体形态的癌症类型依赖性差异、更快的癌细胞增殖以及相比2D培养降低的顺铂敏感性。掺入Matrigel作为ECM组分的异型乳腺癌-骨球状体已被进一步开发以模拟与乳腺癌骨转移相关的细胞相互作用。该模型通过球状体生长、活力和促转移基因表达表征。 类似地，结合转移性前列腺癌细胞与成骨细胞和内皮细胞的微流控3D共培养模型维持癌细胞活力同时显著降低增殖，作者将其解释为更代表转移性骨龛中的生理性肿瘤生长。 尽管有这些进展，单独的球状体模型在重现骨转移期间骨微环境方面仍然有限，特别是肿瘤细胞、骨驻留细胞和ECM组分之间复杂的相互作用。它们缺乏矿化骨基质、骨特异性细胞群体以及骨微环境特有的机械和结构线索。因此，球状体最适合解决关于肿瘤细胞内在行为、早期微转移事件和药物响应的特定问题，而非整个骨转移级联。 类器官：类器官是源自患者组织的自组织3D培养物，保留原始肿瘤的遗传和表型特征。它们已成为研究癌症生物学和药物响应的强大平台，包括骨转移。患者来源类器官可捕捉患者特异性表型和药物响应、基因组和功能异质性（包括跨骨骼病变的分子进化）、骨髓龛定植以及骨骼龛内肿瘤-免疫串扰。它们可作为“活生物库”维持，比PDX模型资源需求更少地提供表型分析和药物响应研究。然而，它们具有有限成熟度和细胞异质性、不完整的天然肿瘤微环境、通常缺乏功能性血管系统、基质或免疫组分，且成本高、劳动密集，使用通用基质。 组织工程和支架模型：组织工程和支架模型旨在通过提供模拟骨ECM物理和生化特性的3D支架来重现骨微环境。这些模型可捕捉归巢和定植、休眠和向增殖性生长转变、骨拟态、基质侵袭和外渗、肿瘤诱导的骨稳态破坏、基质硬度对转移行为的影响以及不同细胞群体间侵袭潜力的差异。它们具有可调硬度、矿物质含量、趋化因子递送和细胞组成，模拟选定骨龛特征，并与药物测试、成像和单细胞RNA测序等分析兼容。然而，它们存在细胞分布不均匀、血管化和光学可及性有限、复杂性降低通量、可重复性和标准化，且主要依赖永生化细胞系。 小鼠模型：小鼠模型在系统哺乳动物背景下捕捉持续骨骼定植、免疫介导的肿瘤-骨相互作用、归巢至小梁和骨内膜龛、溶骨性和成骨性病变、肿瘤诱导的骨结构、骨细胞陷窝和基质特性变化以及SWAP70在定植中的作用。它们允许纵向多尺度成像（BLI、micro-CT、双光子显微镜、电子显微镜、拉曼光谱和SAXS/WAXS），同基因模型捕捉免疫参与，人源化构建提高物种特异性龛相关性。然而，它们仅部分重现人类骨骼转移，途径依赖性绕过级联步骤，物种依赖性免疫差异，成本高，伦理负担，可扩展性和实验变异性有限，人源化骨模型需要稀缺新鲜人骨。 斑马鱼模型：斑马鱼模型在单细胞分辨率下捕捉早期播散、血管停滞、外渗模式和早期龛相互作用，肿瘤-内皮和肿瘤-巨噬细胞相互作用，归巢至CHT和头部早期骨形成部位，调节基因表达对细胞存活和外渗的影响，以及患者来源CTC行为（包括血管内动力学和停滞模式）。它们具有快速外部发育、光学透明性、荧光报告系、单细胞水平高分辨率活体成像、高通量潜力、易于遗传操作，以及胚胎/幼体阶段不成熟适应性免疫系统促进异种移植无需免疫抑制。然而，直接血管注射绕过早期级联步骤且不重现完整转移过程，物种特异性宿主龛和温度差异可能影响肿瘤行为和转化，适应性免疫响应代表性有限。

研究背景与问题：骨是乳腺癌和前列腺癌最常见的远处转移部位，晚期患者累及率可达70%，肺癌、肾癌和甲状腺恶性肿瘤亦常转移至骨。骨转移引发的病理性骨折、高钙血症、脊髓压迫和疼痛严重损害生活质量，且一旦形成基本不可治愈，现有治疗主要针对症状控制和预防骨骼相关事件，而非消除疾病。尽管临床常见且研究数十年，骨定植机制仍未完全阐明，部分原因在于含肿瘤细胞的患者来源骨活检材料稀缺，限制了对人类疾病的直接研究，使临床前模型成为不可或缺的工具。然而，没有单一模型能够完全复制骨转移的生物学复杂性，因此需要以生物学问题为导向，系统评估各模型的贡献、局限及组合方式。研究人员开展本综述，旨在梳理体外2D培养、球状体、类器官、组织工程支架模型、小鼠模型和斑马鱼模型等互补方法，明确各系统适合回答的问题，为骨转移研究提供方法学框架。

关键技术方法：本综述为方法学综述，未开展原始实验。所涉及的关键技术体系包括：二维（2D）单层细胞培养及破骨细胞分化与骨吸收试验（TRAP染色、鬼笔环肽/DAPI染色、Von Kossa染色、Actin-GFP活细胞成像、FRAP、肌动蛋白环再形成试验）；三维（3D）球状体共培养与微流控共培养；患者来源类器官；组织工程与支架模型；小鼠异种移植与原位模型，结合生物发光成像（BLI）、micro-CT、双光子显微镜、电子显微镜、拉曼光谱和SAXS/WAXS等多尺度成像；斑马鱼幼体异种移植与单细胞分辨率活体成像。样本来源方面，提及CTC-ITB-01建立自晚期转移性乳腺癌患者外周血，CTC-3亦来自乳腺癌患者，人破骨细胞可源自外周血单核细胞。

研究结果：

1. 1.
   引言：指出骨转移级联包括肿瘤细胞脱落、ECM侵袭、内渗、CTC循环、外渗和DTC休眠或增殖，原发肿瘤微环境和骨微环境均积极参与；强调以问题为导向选择实验系统，而非以方法出发。
2. 2.
   骨转移生物学：2.1 肿瘤细胞播散：EMT促进肿瘤细胞释放但非完成前提，CTC常保留上皮标志物；肌动蛋白细胞骨架动态重塑支撑阿米巴样和间质样迁移切换；内渗依赖侵袭伪足、Mena-INV稳定cortactin磷酸化及波形蛋白增加细胞硬度；CTC稀少且半衰期短，仅0.02–0.1%存活归巢；CXCL12-CXCR4轴介导骨归巢，SWAP70缺陷4 T1细胞在BALB/c小鼠中骨和肺转移减少、骨病变减轻；DTC可休眠数年至数十年。2.2 骨微环境作为转移龛：窦状毛细血管通透性和慢血流促进CTC附着；骨髓细胞群体和矿化基质释放TGF-β、IGF-1等生长因子；DTC与造血干细胞竞争龛位，稳定微血管与休眠相关、血管出芽与再激活相关；骨髓脂肪组织（BMAT）通过脂质转移和旁分泌信号影响肿瘤细胞。2.3 肿瘤-骨串扰：前列腺癌以成骨性为主、乳腺癌以溶骨性为主、肺癌以溶骨性为主；肿瘤细胞分泌因子经IL-11或RANKL/OPG通路激活破骨细胞，形成恶性循环；破骨细胞F-actin环（封闭区）形成依赖WASp、ARP2/3、Rac1/Rac2、cofilin和SWAP-70；骨细胞与肿瘤细胞可直接接触（图1）；唑来膦酸和硼替佐米已用于抑制破骨细胞生成和骨吸收。
3. 3.
   体外模型：3.1 2D细胞培养：MDA-MB-231及其骨趋向亚克隆、MCF-7、PC-3、LNCaP、C4–2和4 T1等细胞系广泛使用；CTC-ITB-01在导管内PDX中形成原发瘤并自发转移，骨离体生物发光最高，与患者疾病分布一致；CTC-3显示更强增殖侵袭能力和更大CD44⁺/CD24^?亚群；破骨细胞可从RAW 264.7、骨髓单核细胞或外周血单核细胞生成，并通过TRAP、鬼笔环肽/DAPI、Von Kossa和吸收坑定量评估（图2）；2D模型缺乏3D结构、骨基质和机械线索，长期培养致转录组漂移。3.2 3D模型：球状体为无支架聚集体，具分层结构（增殖外层、静息内层、坏死核心），可共培养基质细胞，双光子成像显示癌细胞沿CXCL12梯度迁移；骨转移球状体共培养揭示癌症类型依赖性形态差异、更快增殖和降低的顺铂敏感性；微流控3D共培养中前列腺癌细胞与成骨细胞和内皮细胞共培养维持活力但降低增殖。类器官保留患者遗传和表型特征，可作活生物库，但缺乏成熟血管、基质和免疫组分。组织工程支架模型可调硬度和矿物质含量，模拟选定龛特征，但血管化和光学可及性有限。3.3 小鼠模型：在系统哺乳动物背景下重现骨骼定植、免疫相互作用、溶骨和成骨病变，支持BLI、micro-CT、双光子、电镜、拉曼和SAXS/WAXS纵向多尺度成像；同基因模型捕捉免疫参与，人源化构建提高物种相关性，但仅部分重现人类疾病、成本高、伦理负担重。3.4 斑马鱼模型：幼体光学透明，支持单细胞分辨率实时成像早期播散、血管停滞、外渗和龛相互作用；胚胎/幼体适应性免疫不成熟便于异种移植；但直接血管注射绕过早期级联，物种差异和温度差异可能影响转化。

讨论与结论：综述强调没有单一模型能捕捉骨转移进展的全过程，多尺度成像将肿瘤细胞行为与骨基质重塑联系起来，肌动蛋白细胞骨架动态连接肿瘤细胞播散与破骨细胞活性，患者来源CTC提供生物学上更接近的模型，斑马鱼成像允许在单细胞尺度追踪患者来源肿瘤细胞。各模型的价值在于与具体生物学问题的匹配，并需在了解其能与不能捕捉之内容的前提下解读结果。未来应结合互补系统，以问题驱动方式推进骨转移机制研究和治疗靶点发现。