基于流式细胞术的CD19靶向CAR-T细胞定量流程 harmonization：多中心实验室间比对结果

《Cytometry Part B: Clinical Cytometry》：Harmonizing flow-based quantification of CD19-directed CAR-T cells: Results from a multi-center interlaboratory comparison

　　

CD19靶向CAR-T细胞（chimeric antigen receptor T cells）疗法已成为复发/难治性大B细胞淋巴瘤（LBCL）、套细胞淋巴瘤（MCL）、滤泡性淋巴瘤（FL）及B细胞急性淋巴细胞白血病（BCP-ALL）的标准治疗。患者外周血（PB）中CAR-T细胞在输注后最初数周的扩增是预测治疗反应及毒性发生的重要生物标志物。重要的是，跨研究及跨中心对CAR-T细胞扩增数据进行有意义的比较和汇总需要 harmonized 的定量方法。因此，研究人员联合开发并 harmonized 了一种基于流式细胞术的CD19靶向CAR-T细胞定量工作流程，并为位于德国、奥地利和瑞士的中心建立了外部质量评估（EQA）方案。CAR-T细胞采用双平台法（dual-platform approach）检测，整合了PE偶联的FMC63独特型抗体（idiotype antibody）。该检测方法使用CAR-T细胞患者及加标（spiked）CAR-T细胞的健康供者PB进行了验证。准确性在三次采用 harmonized 工作流程的实验室间比对中进行了评估。此外，研究人员建立了CD19-CAR-T细胞定量的EQA方案，也包括其他定量方法。使用该工作流程，研究人员发现CAR-T细胞定量具有高灵敏度（LOD/LLOQ：CD45⁺事件的0.02/0.03%或0.9/1.5个CAR-T细胞/μL），并观察到高批内精密度，变异系数（CV）通常低于10%。CAR-T细胞稳定性对定量构成挑战，当EDTA血在样本采集后3天进行分析时，导致CAR-T细胞浓度约低估4倍。然而，通过使用Streck Cell Preservative进行样本稳定化可显著改善。实验室间比对强调了该工作流程的准确性，其依赖于 harmonized 的门控策略及以下整合了绝对白细胞计数的公式。来自四次EQA测试（包括七个样本、31个参与中心及多种定量方法）的结果显示了CAR-T细胞定量的测量不确定度，%CV在16%至92%之间，取决于绝对CAR-T细胞水平。重要的是，应用本文所述 harmonized 工作流程的实验室显示出明显改善的定量结果一致性（4.9–69 %CV），相比其他定量方法（26–158 %CV）。总之，研究人员报告了一种简单且可重复的工作流程，用于CD19-CAR-T细胞的常规定量，该流程可轻松适配其他靶抗原。与EQA测试中观察到的变异性相反，使用所述 harmonized 工作流程的实验室间测试证明了改善的一致性。这强调了湿实验和干实验程序全面 harmonization 的重要性，以实现可比较的CAR-T细胞定量结果。

**研究背景与问题**

CD19靶向CAR-T细胞疗法自2017年首次获批以来，其适应症已从B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）和大B细胞淋巴瘤（LBCL）扩展至套细胞淋巴瘤（MCL）、滤泡性淋巴瘤（FL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）及边缘区淋巴瘤等。截至2025年底，美国与欧盟已批准五种CD19靶向CAR-T细胞产品，包括Tisagenlecleucel（Tisa-cel）、Axicabtagen ciloleucel（Axi-cel）、Brexucabtagene autoleucel（Brexu-cel）、Lisocabtagene maraleucel（Liso-cel）和Obecabtagene autoleucel（Obe-cel）。除Obe-cel外，所有获批产品均依赖源自鼠抗人CD19抗体克隆FMC63的单链可变片段（scFv），这为不依赖产品的CAR-T细胞定量策略提供了基础。外周血中CAR-T细胞扩增已被证明是预测治疗反应和毒性发生的重要生物标志物，例如一项回顾性分析显示DLBCL患者输注后第7天CAR-T细胞扩增与治疗反应相关，cutoff值为19个CAR-T细胞/μL；CAR-T细胞扩增还与免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）和细胞因子释放综合征（CRS）的等级显著相关。因此，CAR-T细胞扩增的检测和监测是重要的诊断工具。然而，跨研究和跨中心对CAR-T细胞扩增数据进行有意义的比较和汇总需要 harmonized 的定量方法，而目前缺乏统一的定量框架。基于此，研究人员开展了本项研究，旨在建立并 harmonize 一种基于流式细胞术的CD19靶向CAR-T细胞常规定量工作流程，并建立外部质量评估（EQA）方案，以支持跨中心数据整合并指导CAR-T细胞扩增和持续性的临床解读。

**主要关键技术方法**

研究人员采集健康供者（HDs）及CAR-T细胞患者的外周血（PB）样本，并利用逆转录病毒转导健康供者T细胞后经IL-7/IL-15扩增10天，在内部制备含CD28共刺激的第二代CD19-CAR-T细胞用于加标实验。CAR-T细胞定量采用双平台法，将流式细胞术检测的CD45⁺事件与血液分析仪的白细胞计数相关联，使用PE偶联的FMC63独特型抗体进行染色，并以7-AAD作为活/死细胞判别。方法学验证包括：使用10例健康供者样本确定空白限（LOB）和检测限（LOD），通过 dilution series 确定定量下限（LLOQ）和线性；使用30例已知阴性样本评估诊断特异性；通过7天纵向监测评估样本稳定性并比较不同抗凝剂和稳定剂；通过单平台计数微球法、替代性Stain/Lyse/No wash流程及数字PCR（dPCR）进行跨方法准确性验证；开展三轮实验室间比对（共11个德国和奥地利实验室参与）；与INSTAND合作开展包含31个参与中心的EQA测试（样本经Streck Cell Preservative稳定化）；并进行in silico EQA测试及多变量线性混合模型分析。样本采集经慕尼黑路德维希-马克西米利安大学机构审查委员会批准。

**研究结果**

**CAR-T细胞定量**：研究人员于2019年初启动CAR-T细胞流式定量工作，最初采用基于生物素化CD19抗原和二级抗生物素抗体的两步染色方案，后与德国和奥地利其他流式诊断实验室合作，经多轮协商确定以CD45判别白细胞、CD3门控T细胞，并纳入CD4和CD8（因其在CAR-T细胞治疗中具有高临床相关性），切换至FMC63独特型抗体以实现更高特异性和更短的一步染色流程，并纳入7-AAD作为活/死判别及样本质量控制。CAR-T细胞门控策略如原文图1所示，定量依赖双平台法，将常规血液计数获得的白细胞计数与流式细胞仪检测的CD45⁺事件相关联。

**基于流式的CAR-T细胞定量灵敏且可重复**：通过10例健康供者样本确定LOB为CD45⁺事件的0.01%或0.6个CAR-T细胞/μL，LOD为0.02%或0.9个CAR-T细胞/μL。在11例B细胞恶性肿瘤患者治疗前样本、9例接受BCMA-CAR-T细胞治疗的多发性骨髓瘤患者样本及10例健康供者样本中评估临床特异性，所有样本结果均低于LOD，诊断特异性为100%（95% CI：88.4%–100%），证明FMC63独特型抗体的特异性。通过三例健康供者PB加标CAR-T细胞的稀释系列（每样本三重复）确定LLOQ为CD45⁺事件的0.03%或1.5个CAR-T细胞/μL，重复样本CV通常低于10%，表明高批内精密度；测定线性在全浓度范围内得到确认，合并线性回归斜率为0.994（95% CI：0.987–1.00），截距为0.349（95% CI：0.206–0.492），R²=0.999，无显著失拟。该工作流程适配BCMA-CAR-T细胞后，LOB、LOD和LLOQ分别为0.5、0.7和1.6个CAR-T细胞/μL。

**CAR-T细胞定量对样本稳定性敏感**：六例CAR-T细胞患者PB样本以EDTA和肝素抗凝，在采血当日定量结果无显著差异。纵向监测显示，相对于采集当日，采血后1天可检测CAR-T细胞即显著下降（EDTA：49±14%；肝素：65±11%），3天后进一步降至23±9%和25±1%。评估不同稳定剂发现，Transfix在第3天仅 modest 改善（38±3%），而Streck Cell Preservative（72±4%）和CytoChex（80±2%）稳定化后CAR-T细胞定量受损较小；延长储存至第7天分别降至63±6%和63±10%。含自体CAR-T细胞的患者样本与含同种异体CAR-T细胞的健康供者样本之间无差异。非稳定化EDTA和肝素样本中CD3⁺T细胞相对于CD45⁺细胞随时间相对增加，CAR-T细胞在CD3⁺T细胞中的相对频率随时间下降，表明活化CAR-T细胞相对于静息T细胞的高脆弱性；所有测试的稳定试剂均能维持CD3⁺T细胞频率。这强调CAR-T细胞定量对样本稳定性敏感，若不能立即分析可使用稳定剂改善。

**方法和实验室间比对证明定量流程的准确性**：由于目前缺乏建立CAR-T细胞定量准确性数值的参考方法，研究人员通过比较单平台与双平台方法、与已建立的dPCR工作流程进行实验室间比对、以及使用所开发流程进行实验室间比对来评估准确性。基于Lyse/Wash/Stain/Wash的双平台流程与Stain/Lyse/No wash方法及基于计数微球的单平台方法结果总体高度一致。13例加标CAR-T细胞的健康供者样本同时经dPCR和双平台流程分析，显示良好相关性（R²=0.9667），dPCR结果约高1.9倍，最可能归因于加标CAR-T细胞转导率测定的差异，此外dPCR还检测因表观遗传和转录改变而不转录或弱转录的载体拷贝。三轮连续实验室间比对（共11个德国和奥地利参与中心）使用CD19 CAR-T细胞患者非稳定化EDTA血，所有中心在采血后1天按共识方案进行定量。第一份样本（6个参与中心）初始结果异质性较大，CV为31%，范围42–118个CAR-T细胞/μL，进一步分析表明主要源于不同的计算方法和门控策略；采用 harmonized 分析方案后差异降至CV 5.3%，范围91–105个CAR-T细胞/μL（中位数101个CAR-T细胞/μL）。第二轮实验室间比对（6个参与中心，其中4个首次参与）证实了 harmonized 且共同商定的CAR-T细胞定量方法的可重复性，CV为16%，范围59.9–94.7个CAR-T细胞/μL，中位浓度为72.5个CAR-T细胞/μL，约四个实验室达到该值，两个新参与实验室因门控和仪器设置差异显示较大偏差。第三轮实验室间比对中，中位浓度为1.7个CAR-T细胞/μL的样本由10个参与中心分析，观察到CV为68%，与LLOQ样本的泊松计数统计一致；除一个首次参与的实验室外，所有报告值均在0.6至1.9个CAR-T细胞/μL之间。

**harmonization 对跨中心定量结果可比性至关重要**：在实验室间比对及德国、奥地利和瑞士医学血液学和肿瘤学学会日益增长的成员请求推动下，研究人员与INSTAND合作启动了更广泛的EQA方案。研究人员决定不对CAR-T细胞定量方案施加限制，以评估其他定量概念；由于预计瑞士的海关运输延迟，改为使用Streck cell preservative稳定化EDTA血；由于定量概念多样，根据ISO 13528:2022采用Algorithm A计算共识值和标准差。2024年11月进行的首次EQA测试有20个参与中心，包括一份CAR-T细胞患者样本和一份加标样本，确定的共识浓度分别为29.3和79.4个CAR-T细胞/μL，CV分别高达78%和60%。随后三次能力验证测试进一步证实了高测量不确定度：一份共识CAR-T细胞浓度为70.8个CAR-T细胞/μL的患者样本CV仅为16%，而另一份仅3.9个CAR-T细胞/μL的患者样本CV为92%。CAR-T细胞在CD45⁺细胞中相对比例的结果显示类似的测量不确定度。更详细的分析显示，使用本文所述方案或类似使用FMC63独特型抗体的方案的实验室，绝对定量的CV通常较低（4.9%–69%）；相反，主要基于生物素化CAR检测试剂两步染色的其他定量方法显示出明显更高的CV（26%–158%），强调方法 harmonization 的必要性。

**CAR-T细胞定量中测量不确定度的决定因素**：鉴于非 harmonized EQA测试中观察到的测量不确定度，研究人员尝试识别 contributing 参数。首先评估稳定试剂的影响，因其可能干扰相当部分参与中心使用的基于生物素的检测试剂；观察到与FMC63独特型抗体一步染色相比，基于生物素的方案对细胞非特异性染色，导致额外的CAR^dim群体。因此，研究人员使用加标CAR-T细胞的非稳定化血样本进行了三次实验室间比对，基于24–27个参与中心的结果确定共识值分别为60.7、53.6和147个CAR-T细胞/μL，CV为34%–52%，与稳定化样本的能力验证测试相当；使用FMC63方案的11–16个实验室CV较低（13%–37%），而使用其他定量方法（主要包括基于生物素的检测试剂）的11–13个实验室CV为19%–74%。因此，研究人员得出结论：样本稳定化对基于生物素的定量检测引入了额外挑战，但并非EQA中观察到的测量不确定度的主要驱动因素；这得到以下发现的支持：CD45⁺细胞中CD3⁺细胞频率（比CAR-T细胞更稳健的染色靶标）在稳定化样本中也显示相当大的中心间变异，指向更广泛的方案不一致作为变异性的主要来源。此外，各实验室报告的白细胞计数差异仅较小，平均CV为7.3±3.8%（±SD），表明血液分析仪的白细胞定量仅起次要作用。接下来评估门控策略和计算方法的差异，为此使用一份CAR-T细胞患者样本的数据文件进行in silico EQA测试，要求参与中心根据公式并使用4000个细胞/μL的白细胞计数及最接近其常规CAR-T细胞定量方案的门控策略进行定量；基于20个参与中心的结果确定共识值为106个CAR-T细胞/μL及CD45⁺细胞中2.6%的CAR-T细胞，结果总体一致性良好，绝对和相对定量的CV分别为5.6%和5.7%。这表明样本处理和采集而非数据分析是测量变异性的主要驱动因素。多变量分析调查样本年龄、检测试剂、流式细胞仪、红细胞裂解缓冲液、样本稳定化及单平台与双平台方法对偏离共识CAR-T细胞浓度的贡献，显示样本年龄显著（p=0.003）增加偏离共识CAR-T细胞浓度的程度，与样本稳定性观察一致；其他测试变量未见显著贡献。然而，当基于±50%能力验证通过接受标准将偏离共识CAR-T细胞浓度二分类时，使用FMC63独特型抗体相比基于生物的检测方法显著降低超过该限值的几率（p=0.027）；这一差异可由基于生物的检测方法定量结果均值相当但精密度显著较低来解释。一些参与EQA方案的实验室提供的原始数据文件还显示不当的红细胞裂解和门控序列中的T细胞群体 cut-through 作为额外个体误差来源；一个实验室的数据突出表明，当将CD45⁺细胞与白细胞计数相关联时，需要 proper harmonization 流式细胞仪和血液分析仪设置，前向和侧向散射应调整以完全分辨所有白细胞亚群尤其粒细胞；另一数据集显示门控序列问题，即门控活CAR-T细胞而CD45⁺群体包含死细胞，导致相对CAR-T细胞频率失真。然而，并非所有实验室的测量不确定度原因都能完全解析。

**讨论部分总结**

CAR-T细胞扩增已被证明是预测治疗反应和临床决策的重要生物标志物。本研究中，研究人员描述了使用双平台法建立CD19-CAR-T细胞定量工作流程，将流式细胞术确定的相对CAR-T细胞计数与血液分析仪确定的绝对白细胞计数相关联。使用PE偶联的FMC63独特型抗体，研究人员发现CAR-T细胞定量高度灵敏（LOD/LLOQ：CD45⁺事件的0.02/0.03%或0.9/1.5个CAR-T细胞/μL）且高度精确，CV通常低于10%。然而，样本稳定性在CAR-T细胞定量中起关键作用，采血后1天可检测CAR-T细胞即显著下降，因此CAR-T细胞样本应于当日分析；如有必要，样本可用Streck Cell Preservative稳定化，此时FMC63独特型抗体仍显示优异染色特性，而生物素标记的CAR检测试剂则不然。后者通常由生物素标记的靶抗原片段（如CD19或BCMA）组成，通过二级抗生物素抗体检测，其配体基础检测具有跨不同CAR构建体（包括Obe-cel等替代CD19靶向CAR-T产品）更广泛适用性的优势，但据报道在存在靶向同一肿瘤抗原的双特异性抗体（用作桥接治疗）时会产生假阳性结果。另一种替代方法依赖检测CAR受体scFv中的 linker 区域（通常含Whitlow或G4S linker），虽已显示一般可行性，但定量结果的灵敏度依赖于CAR-T细胞产品：使用二级抗Whitlow linker染色检测Brexu-cel相比生物素化CD19-CAR检测试剂灵敏度为95.8%，而荧光团偶联的linker抗体结果较差（Brexu-cel灵敏度79.3%）；使用抗G4S linker抗体检测Tisa-cel灵敏度仅61.1%，且该抗体在全血样本中与BD FACS裂解液一起显示非特异性结合，强调需要改进的linker抗体克隆。相反，研究人员观察到FMC63基础检测高度特异且与样本稳定试剂兼容。其次，研究人员在两种不同设计的循环测试中评估CAR-T细胞定量，当所有实验室按同一 quantitation 方案工作时，实验室间比对显示高度一致性，一份中位频率为101个CAR-T细胞/μL的样本CV低至5.3%，这也反映了加标样本测定性能CV通常低于10%的观察；相反，在未对定量方案施加限制的EQA方案中观察到16%–92% CV的更高测量不确定度。欧盟和美国监管机构尚未定义CAR-T细胞定量的接受标准；测量不确定度除其他外取决于细胞亚群的频率，例如EQA方案中NK细胞观察到约25% CV；鉴于CAR-T细胞低频率及缺乏完善的CAR-T定量方案，研究人员因此认为±50%的偏差可接受，在通过更 harmonized 的测试达到改善的实验室间可比性后应降至20%–30%。在尝试识别测量不确定度变量时，研究人员观察到FMC63基础定量方案相比其他检测试剂（包括受样本稳定化挑战的基于生物的定量）显示总体较低变异；当使用相同计算方法时，数据分析差异较不重要，如in silico 循环测试所观察，表明样本处理差异是主要变异因素；然而确切原因往往难以捉摸，可能也包括个体原因，这得到多变量分析进一步证实，除样本年龄外未识别出其他显著贡献测量不确定度的变量；值得注意的是，相比分析的变量，数据点数量有限，红细胞裂解缓冲液和单平台与双平台方法等潜在 contributing 因素应在未来系统分析。样本处理的其他潜在定量差异可能源于洗涤与不洗涤方案的差异；研究人员工作流程中使用的裂解-洗涤方案结合白细胞亚群对红细胞裂解缓冲液的不同敏感性及离心过程中的细胞丢失，可导致相对细胞计数变异；然而该方法的一个明确优势是由于较低荧光背景、较少细胞碎片非特异性染色和减少细胞聚集体形成，改善了稀有细胞群体如CAR-T细胞的分辨率；此外，研究人员观察到裂解-洗涤与不洗涤方案之间无相关差异。进一步的差异可能源于绝对计数的总体概念；研究人员工作流程依赖双平台法，将流式细胞术评估的CD45⁺事件与血液分析仪报告的白细胞计数相关联，但这需要两台机器的准确 harmonization，例如通过优化流式细胞仪上的触发通道、前向/侧向散射和CD45⁺门控以实现白细胞检测的完全一致；鉴于EQA测试中白细胞计数高度可比且变异性可接受为±10%，血液分析仪类型最可能作用较小；然而研究人员未在EQA方案中获取所用血液分析仪的信息以进一步研究该因素。双平台法的替代方案是使用计数微球的单平台法，但准确 quantitation 可能因计数微球浓度的测量不确定度及微球沉降和聚集等而具有挑战性；此外，计数微球的准确移液至关重要，而双平台法较少受移液误差影响；有趣的是，关于T细胞和CD34⁺细胞定量的研究发现单平台与双平台方法之间的实验室间变异相当。使用双平台法得到研究人员准确性验证的进一步支持，显示与使用计数微球的单平台方法相比结果高度一致。另一种替代方案是体积计数，已被证明与单平台法等效；然而这需要能够准确监测采集体积的流式细胞仪，而常规诊断实验室通常不具备。尽管如此，仍需要建立报告CAR-T细胞定量绝对数值的参考方法。总之，研究人员报告了一种简单且可重复的工作流程，用于CD19-CAR-T细胞的常规定量，该流程可轻松适配其他靶抗原如BCMA及非FMC63基础的CD19-CAR-T细胞如Obe-cel。与EQA方案中观察到的变异性相反，使用所述工作流程后观察到定量结果一致性的改善。这强调实验室间湿实验和干实验工作流程全面 harmonization 的必要性，以实现可比较的CAR-T细胞定量结果。

**研究结论翻译**

总之，研究人员报告了一种简单且可重复的工作流程，用于CD19-CAR-T细胞的常规定量，该流程可轻松适配其他靶抗原。与EQA测试中观察到的变异性相反，使用所述 harmonized 工作流程的实验室间测试证明了改善的一致性。这强调了湿实验和干实验程序全面 harmonization 的重要性，以实现可比较的CAR-T细胞定量结果。