《Journal of Biological Chemistry》：Targeting CLDN3 Enhances PD-1 Blockade Efficacy in Gastric Cancer by Disrupting the NF-κB/p65–CXCL1–PD-L1 Immune Evasion Axis
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胃癌（GC）仍然是全球癌症相关死亡的主要原因之一。Claudin 3（CLDN3）是一种紧密连接蛋白，在多种恶性肿瘤中异常表达，并被认为与肿瘤进展相关。然而，其在GC中的功能意义和治疗相关性仍未完全明确。因此，研究人员利用临床队列分析、体外和体内实验、免疫共培
胃癌（GC）仍然是全球癌症相关死亡的主要原因之一。Claudin 3（CLDN3）是一种紧密连接蛋白，在多种恶性肿瘤中异常表达，并被认为与肿瘤进展相关。然而，其在GC中的功能意义和治疗相关性仍未完全明确。因此，研究人员利用临床队列分析、体外和体内实验、免疫共培养系统以及转录组学和蛋白质组学分析，系统评估了CLDN3在GC中的功能作用及其潜在机制。研究人员还利用杂交瘤技术制备了针对CLDN3的单克隆抗体，并在体外和体内评估了其抗肿瘤疗效，包括单药治疗以及与抗PD-1阻断联合治疗的效果。CLDN3在GC组织中表达上调，并与不良预后、侵袭性临床病理特征以及瘤内CD8+ T细胞浸润减少相关。在机制上，CLDN3通过促进p65磷酸化和核转位激活NF-κB通路，从而增强CXCL1转录，进而驱动GC细胞增殖、迁移和侵袭。此外，CLDN3以CXCL1依赖的方式上调PD-L1表达，导致CD8+ T细胞浸润减少和CD8+ T细胞介导的肿瘤细胞杀伤减弱。值得注意的是，抗CLDN3单克隆抗体表现出高结合亲和力和特异性，在体内显著抑制肿瘤生长和转移，并增强了抗PD-1阻断的抗肿瘤疗效，同时伴随CD8+ T细胞浸润增加。总体而言，这些发现表明CLDN3通过激活NF-κB/p65–CXCL1–PD-L1信号轴促进GC进展和免疫逃逸，而CLDN3阻断联合PD-1抑制可能代表一种有前景的GC治疗策略。
研究背景：根据2022年全球癌症统计数据，胃癌（GC）是全球第五大常见恶性肿瘤，发病率和死亡率均较高，全球疾病负担沉重。尽管早期筛查和治疗进展使GC相关死亡率有所下降，但由于缺乏明显的早期症状，多数患者确诊时已处于晚期。手术切除和全身化疗仍是当前治疗策略的关键组成部分，但晚期GC患者预后仍不理想，5年总生存率通常低于30%，远处转移患者更降至不足10%，亟需更有效的治疗手段。近年来，靶向治疗和免疫治疗等策略展现出前景，但靶向治疗受限于获得性耐药、患者资格受限和治疗相关毒性，免疫治疗则受限于相对较低的应答率和免疫相关不良事件。因此，发现新的治疗靶点对于改善GC患者预后至关重要。Claudin（CLDN）家族蛋白是紧密连接的组成部分，对维持上皮细胞极性和屏障功能至关重要。CLDN3在上皮组织中丰富表达，对维持紧密连接完整性和细胞极性至关重要。除结构功能外，CLDN3还参与调控细胞增殖、分化和免疫应答。多种CLDN家族成员在多种癌症类型中异常表达。越来越多证据表明CLDN3参与多种恶性肿瘤进展，包括肝细胞癌、乳腺癌、结直肠癌和卵巢癌。大规模组织芯片研究显示CLDN3在多种上皮肿瘤（包括GC）中频繁过表达。Zhang等发现CLDN3在肠化生和原发性GC组织中均上调。此外，近期报道CLDN3在"冷"胃肿瘤中过表达，其表达与CD8+ T细胞浸润呈负相关。尽管存在这些相关性发现，CLDN3在GC中的生物学功能、其致癌活性的潜在机制及其对肿瘤免疫微环境的影响仍未充分明确，从而限制了CLDN3作为治疗靶点候选的临床转化。为解决这一空白，研究人员旨在研究CLDN3在GC中的表达模式和临床意义，并阐明CLDN3如何通过NF-κB/CXCL1信号轴促进肿瘤增殖、侵袭和免疫抑制。此外，研究人员开发了靶向CLDN3的单克隆抗体，并在细胞模型和动物模型中评估了其单独或联合抗PD-1治疗的抗肿瘤活性。这些发现明确了CLDN3在GC中的生物学功能和机制基础，并为开发CLDN3靶向治疗和合理的联合免疫治疗策略提供了实验依据。
主要技术方法：研究人员采用临床队列分析（Cohort I含160例GC手术切除患者组织用于免疫组化；Cohort II含20对GC及癌旁组织用于免疫荧光；Cohort III含10对新鲜冷冻组织用于qRT-PCR和Western blot），结合TCGA和GEO（GSE118916）数据库进行生物信息学分析；利用CCK-8、集落形成、伤口愈合、Transwell实验进行体外功能研究；建立皮下异种移植、脾注射肝转移和人源肿瘤异种移植（PDX）模型进行体内研究；采用RNA测序、细胞因子抗体芯片、ELISA进行转录组和细胞因子分析；通过免疫共培养系统评估T细胞杀伤功能；利用杂交瘤技术制备抗CLDN3单克隆抗体，并通过ELISA、流式细胞术、表面等离子共振（SPR）进行抗体表征；采用染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR和双荧光素酶报告基因实验验证p65与CXCL1启动子的结合。
研究结果：
CLDN3在GC中上调并与GC进展临床相关：通过TCGA和GTEx数据库分析33种癌症类型中CLDN3表达，发现GC中CLDN3 mRNA显著升高（P < 0.001）；GSE118916数据集进一步证实CLDN3在GC中显著上调；对Cohort I 160例GC患者组织的免疫组化（IHC）分析显示CLDN3蛋白主要定位于质膜，在GC组织中显著高于癌旁非恶性组织（P < 0.0001）；qRT-PCR和Western blot分析进一步验证CLDN3 mRNA和蛋白在GC组织中上调（P < 0.01）；Kaplan–Meier生存分析显示高CLDN3表达与较短总生存期（OS）显著相关（P < 0.05）；高CLDN3表达与晚期N分期（P = 0.049）和血管侵犯（P = 0.037）呈正相关；单因素Cox回归分析显示高CLDN3表达与死亡风险增加相关（HR = 2.13，95% CI：1.16–3.93，P = 0.015），多因素分析校正TNM分期和血管侵犯后CLDN3表达显示较差OS趋势但未达统计学显著性（HR = 1.76，95% CI：0.94–3.28，P = 0.076）。结论：CLDN3在GC中过表达，与不良预后和侵袭性肿瘤表型相关。
CLDN3促进GC生长和转移：与正常胃上皮细胞系GES-1相比，GC细胞系MKN45、MKN74和KATO-III中CLDN3表达显著升高（P < 0.001）；CLDN3敲低显著降低GC细胞增殖（P < 0.001），而CLDN3过表达促进增殖（P < 0.05）；CLDN3敲低显著损害GC细胞迁移和侵袭（P < 0.01），过表达则增强这些恶性表型（P < 0.05）；在免疫缺陷小鼠皮下异种移植模型中，CLDN3敲低显著抑制肿瘤生长（P < 0.01），CLDN3敲低组最终肿瘤重量显著低于对照组（P < 0.01），Ki67增殖指数显著降低；在肝转移模型中，CLDN3敲低显著减少转移结节数（P < 0.05），PET/MRI扫描和H&E染色证实肝转移减少，CD31免疫组化显示CLDN3敲低转移灶微血管密度降低。结论：CLDN3在体外和体内促进GC细胞增殖、迁移、侵袭、肿瘤生长和转移。
CLDN3与GC中CD8+ T细胞浸润减少和抗肿瘤免疫受损相关：免疫浸润分析显示总T细胞（R = –0.363，P < 0.001）和CD8+ T细胞（R = –0.341，P < 0.001）与CLDN3表达呈显著负相关；高CLDN3表达患者总T细胞和CD8+ T细胞富集评分显著低于低表达患者（校正P < 0.001）；高CLDN3表达联合低CD8+ TIL浸润与最短OS相关，而低CLDN3表达联合高CD8+ TIL浸润与最佳预后相关（P < 0.0001）；Cohort II免疫荧光分析显示CLDN3表达与CD8+ TIL浸润呈负相关（P < 0.0001），高CLDN3表达GC组织CD8+ TIL浸润较低（P < 0.0001）；CLDN3表达与PD-L1表达呈正相关（P < 0.0001），高CLDN3表达GC组织PD-L1表达较高（P < 0.0001）；T细胞共培养实验显示CLDN3敲低GC细胞共培养24 h后凋亡比例显著增加（P < 0.05），CD3+CD8+ T细胞比例显著增加（P < 0.0001），PD-L1蛋白表达显著下调（P < 0.05）。结论：CLDN3与CD8+ T细胞浸润减少和PD-L1表达增加相关，可能 contribuir 于GC中CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫受损。
CLDN3上调GC细胞中CXCL1表达：对CLDN3敲低MKN74细胞进行RNA测序，发现455个基因显著差异表达（|log2FC| > 1且FDR < 0.05），包括300个上调和155个下调基因；GO富集分析显示差异表达基因（DEGs）与上皮细胞分化和增殖调控、细胞外基质组织等生物学过程显著相关（校正P < 0.05）；KEGG通路富集分析显示DEGs在多种癌症相关通路中显著富集，尤其是细胞因子–细胞因子受体相互作用通路（校正P < 0.05）；细胞因子抗体芯片显示CLDN3敲低降低CCL5、CXCL1和Serpin E1分泌（P < 0.05）；qRT-PCR验证显示CLDN3敲低显著降低CXCL1和SERPINE1 mRNA水平（P < 0.0001）；ELISA证实CLDN3敲低MKN45和MKN74细胞CXCL1分泌显著减少（P < 0.01），CLDN3过表达HGC27细胞CXCL1分泌显著增加（P < 0.01）。结论：CLDN3在mRNA和分泌蛋白水平正调控GC细胞中CXCL1，确定CXCL1为下游候选分子。
CXCL1介导CLDN3驱动的GC进展和免疫逃逸：用重组人CXCL1（rhCXCL1，100 ng/mL）处理CLDN3敲低MKN45和MKN74细胞，CCK-8实验显示rhCXCL1部分恢复细胞活力，逆转约60%的抑制效应（P < 0.01）；集落形成实验显示rhCXCL1部分挽救受损克隆形成能力（P < 0.01）；伤口愈合和Transwell实验显示rhCXCL1部分恢复迁移和侵袭能力（P < 0.01）；Western blot显示rhCXCL1显著恢复CLDN3敲低细胞PD-L1蛋白水平（P < 0.05）；流式细胞术显示rhCXCL1降低CLDN3敲低GC细胞共培养后的凋亡比例，抗PD-L1抗体逆转此保护效应（P < 0.05）；rhCXCL1增加CLDN3敲低细胞表面PD-L1水平，抗PD-L1抗体降低可检测PD-L1信号（P < 0.05）；rhCXCL1降低共培养后CD8+ T细胞比例，抗PD-L1抗体逆转此降低（P < 0.05）；在MFC细胞肝转移模型中，腹腔注射重组鼠CXCL1（rmCXCL1，10 mg/kg）显著恢复CLDN3敲低细胞的转移能力（P < 0.01），免疫荧光显示rmCXCL1增加肿瘤组织PD-L1表达并减少CD8+ TIL浸润（P < 0.05）。结论：CXCL1作为CLDN3关键下游效应分子，介导CLDN3驱动的GC细胞增殖、迁移、侵袭和转移，同时促进PD-L1依赖的CD8+ T细胞介导抗肿瘤免疫抑制。
CLDN3激活NF-κB通路转录上调CXCL1：Western blot显示CLDN3敲低后总p65和IκBα水平不变（P > 0.05），而磷酸化p65（p-p65）和磷酸化IκBα（p-IκBα）水平显著降低（P < 0.05）；核质分离显示CLDN3敲低降低核p65水平并增加胞质p65水平（均P < 0.01），CLDN3过表达导致p65从胞质向核重新分布（P < 0.05）；免疫荧光证实CLDN3敲低减弱p65核转位（P < 0.001）；用NF-κB抑制剂BAY 11-7082（10 μM，24 h）处理CLDN3过表达HGC27细胞，ELISA显示CXCL1分泌显著减少（P < 0.001）；JASPAR数据库预测CXCL1启动子区5个p65结合基序，ChIP-qPCR显示位点1（?1931/?1922）和位点2（?1956/?1947）的% input值显著高于背景（P < 0.01）；双荧光素酶报告基因实验显示p65表达质粒共转染显著增强野生型CXCL1启动子荧光素酶活性，位点1突变完全消除此激活（P < 0.0001）。结论：CLDN3通过诱导p65磷酸化和核转位激活NF-κB信号，促进p65结合CXCL1启动子并转录上调CXCL1表达。
靶向CLDN3单克隆抗体的开发与表征：用CLDN3 mRNA-脂质纳米颗粒（mRNA-LNPs，每只小鼠10 μg，每2周一次，共4次）免疫BALB/c小鼠，ELISA显示免疫小鼠血清抗体滴度显著升高；细胞融合后杂交瘤上清经ELISA筛选，获得3个稳定杂交瘤克隆；腹腔注射诱导腹水产生，ELISA确认腹水抗体滴度高；流式细胞术验证腹水抗体与CLDN3过表达CHO细胞表面CLDN3强结合，1H1F3E10结合最强；同型鉴定1H1F3E10为IgM/κ同型；免疫亲和层析纯化抗体，SDS-PAGE显示特征重链和轻链条带；免疫荧光显示纯化抗体在MKN45细胞膜定位信号清晰；基于细胞的表面等离子共振（SPR）分析显示浓度依赖性结合动力学（1.073–10,730 nM），平衡解离常数（KD）为3.137 × 10
-9 M（3.137 nM）；流式细胞术显示1H1F3E10选择性结合hCLDN3表达细胞，不与mCLDN3、hCLDN4、hCLDN5、hCLDN6或hCLDN9结合；CLDN3敲低降低1H1F3E10结合（P < 0.01和P < 0.001）。结论：成功制备高亲和力抗CLDN3单克隆抗体，在claudin家族中具有选择性反应性和CLDN3依赖性细胞表面结合。
抗CLDN3抗体增强抗PD-1介导的抗肿瘤疗效：补体存在下，抗CLDN3抗体诱导GC细胞系剂量依赖性补体依赖性细胞毒性（CDC），CLDN3敲低减弱此效应；抗CLDN3抗体（30 μg/mL）显著降低GC细胞活力和克隆生长（P < 0.001和P < 0.01），损害侵袭和迁移能力（P < 0.0001和P < 0.01）；在615小鼠MFC细胞稳定表达人CLDN3的肝转移模型中，抗CLDN3和抗PD-1抗体联合治疗比任一单药或对照更有效抑制肝转移形成（P < 0.05）；在NSG小鼠人PBMC重建的PDX模型中，联合治疗显著抑制肿瘤生长（P < 0.05），肿瘤生长曲线显示联合组肿瘤进展最慢；H&E染色显示联合组肿瘤细胞稀疏、结构破坏和广泛坏死更明显；联合治疗增加肝转移模型和PDX肿瘤切片中CD8+ TIL浸润；流式细胞术显示联合治疗增加PBMC重建PDX小鼠外周血人CD3+ T细胞频率。结论：抗CLDN3抗体发挥直接抗肿瘤活性，并通过抑制肿瘤生长和转移、促进CD8+ T细胞浸润增强PD-1阻断疗效。
讨论部分总结：本研究鉴定CLDN3为GC中临床相关的致癌和免疫调节因子。CLDN3在GC中高表达，与不良预后和侵袭性临床病理特征相关。功能上，CLDN3促进细胞增殖、迁移、侵袭以及肿瘤生长和肝转移。机制上，CLDN3通过刺激p65磷酸化和核转位激活NF-κB通路，增强CXCL1转录。CXCL1作为CLDN3关键下游介质，驱动恶性表型、促进免疫逃逸并减弱CD8+ T细胞毒性。此外，制备的靶向CLDN3单克隆抗体在临床前GC模型中发挥直接抗肿瘤活性并增强PD-1阻断效果。研究进一步将CLDN3致癌作用与趋化因子介导的炎症性肿瘤进展联系起来，确定CXCL1为CLDN3关键下游效应分子。功能挽救实验表明CXCL1不仅是CLDN3下游次要表达变化，而是CLDN3驱动恶性表型的关键功能介质。研究确定CLDN3–NF-κB/p65–CXCL1轴为驱动GC进展的关键信号级联。CLDN3 contribuye 于塑造免疫抑制性肿瘤微环境，与CD8+ T细胞排斥和PD-L1高表达免疫表型相关，CLDN3缺失可能通过减弱PD-L1相关免疫抑制恢复CD8+ T细胞介导的肿瘤细胞杀伤。研究首次在GC中证明CLDN3通过CXCL1依赖的自分泌途径调控PD-L1表达，扩展了对该轴内在免疫调节机制的理解。靶向CLDN3可能通过减弱CXCL1/PD-L1介导的免疫抑制增强GC中PD-1阻断疗效。抗CLDN3抗体显示良好结合特异性和高亲和力（KD = 3.137 nM），体外发挥直接抗肿瘤活性，体内减少肝转移负担并延缓PDX模型肿瘤生长。联合治疗在肝转移模型和PDX模型中比任一单药更有效抑制肿瘤，增加CD8+ TIL浸润。局限性包括：CLDN3激活NF-κB通路的上游分子事件尚待阐明；CXCL1调控PD-L1表达的下游信号通路需进一步明确；CXCL1是否通过招募髓源性抑制细胞（MDSCs）影响CD8+ T细胞浸润和功能需深入研究；体重和主要器官组织学不足以支持抗CLDN3单克隆抗体的良好安全性特征，未来需纳入标准化移植物抗宿主病（GVHD）评分、血液学和血清生化分析及系统临床监测；抗CLDN3抗体不识别小鼠CLDN3，需人CLDN3敲入小鼠等模型充分评估正常组织中的靶向/脱靶毒性；抗CLDN3单克隆抗体为IgM同型，其组织穿透有限和半衰期较短可能阻碍临床转化，未来应聚焦IgG同型转换、抗体人源化及药代动力学和安全性系统评估。
研究结论翻译：总之，本研究表明CLDN3通过NF-κB/p65–CXCL1–PD-L1轴促进GC进展和免疫逃逸。通过激活NF-κB信号并转录上调CXCL1，CLDN3增强GC细胞增殖、侵袭和转移，同时促进PD-L1介导的CD8+ T细胞抗肿瘤免疫抑制。此外，抗CLDN3单克隆抗体抑制GC生长和转移并增强PD-1阻断的治疗疗效。这些发现确定CLDN3为有前景的治疗靶点，并支持开发CLDN3靶向策略以增强GC治疗中免疫检查点阻断的疗效。
