《Journal of Biomedical Science》：The TNKS/PI31–proteasome axis as a central node in TDP-43 neuropathies
Tar DNA结合蛋白43（TDP-43）的病理性聚集与神经元蛋白稳态的破坏是肌萎缩侧索硬化（ALS）、额颞叶变性（FTLD）及相关TDP-43蛋白病的标志性特征。蛋白酶体的高效轴突运输对于维持神经元局部蛋白质质量控制至关重要。蛋白酶体抑制剂31（PI31）既调控26S蛋白酶体的组装，也调控动力蛋白介导的20S蛋白酶体运输。尽管端锚聚合酶1/2（TNKS）介导的PI31 ADP-核糖基化可促进26S蛋白酶体组装，但其在蛋白酶体运输中的作用及其对TDP-43病理的贡献尚不清楚。研究人员采用活细胞成像检测野生型与Prp-TDP-43A315T转基因小鼠原代皮层与运动神经元中20S蛋白酶体的运输；通过免疫沉淀与荧光共振能量转移（FRET）分析TDP-43、TNKS与PI31之间的蛋白相互作用；通过RIPA/尿素分级分离、Western blotting与免疫荧光评估不溶性蛋白积累与共定位；采用天然凝胶电泳与20S蛋白酶体特异性荧光底物评估蛋白酶体组装与活性；通过半变性去垢剂琼脂糖凝胶电泳（SDD-AGE）检测TDP-43聚集。结果显示，在表达TDP-43-FL、TDP-43-A315T或TDP-25的细胞模型及Prp-TDP-43A315T转基因小鼠中，病理性TDP-43种类形成从寡聚体到显著胞质聚集体的不同形式聚集，但均降低蛋白酶体活性、损害轴突蛋白酶体运输，并导致多泛素化蛋白、PI31、20S蛋白酶体及TDP-43在近端轴突与胞体中积累。病理性TDP-43将TNKS与蛋白酶体组分隔离至不溶性组分，从而限制游离可溶性TNKS与PI31相互作用及随后的PI31 ADP-核糖基化，最终损害19S/20S蛋白酶体组装。值得注意的是，破坏TNKS–PI31相互作用或抑制TNKS活性可重现病理性TDP-43诱导的蛋白酶体功能障碍，支持异常TNKS–TDP-43相互作用及随之发生的TNKS介导PI31 ADP-核糖基化受损在TNKS/PI31/蛋白酶体轴功能障碍中的作用。结论认为，病理性TDP-43通过损害TNKS/PI31/蛋白酶体轴破坏蛋白酶体功能，提示该轴可能成为TDP-43蛋白病的潜在治疗靶点。选择性恢复该通路可能增强病理性TDP-43清除，同时最大限度减少非特异性蛋白酶体激活，从而为ALS和FTLD提供更精确、更安全的治疗策略。
**研究背景与问题**
神经退行性疾病以异常错误折叠和泛素化蛋白的不溶性聚集为特征，伴随蛋白质稳态丧失，最终导致进行性神经元死亡和反应性胶质增生。蛋白酶体功能下降被认为是这些错误折叠蛋白异常积累的主要原因，但蛋白酶体功能受损究竟是这些聚集蛋白积累的原因还是结果，仍是一个未解之谜。泛素化包涵体（UBIs）是肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶变性（FTLD）的病理标志，其中Tar DNA结合蛋白43（TDP-43）阳性泛素化包涵体被发现在95%的ALS患者和45%的FTLD-U患者中作为UBIs的主要病理组分。TDP-43是由TARDBP基因编码的414个氨基酸蛋白，在多种物种中高度保守，并在包括大脑在内的所有组织中广泛表达。TDP-43的N端RNA识别基序（RRM I和RRM II）对DNA/RNA结合至关重要，而其富含甘氨酸的C端区域是自调节、外显子跳跃和pre-mRNA剪接抑制反应所必需的。TDP-43同时含有核定位信号和核输出信号，促进其核质穿梭。在生理条件下，TDP-43主要定位于细胞核，调控RNA加工与代谢；较小的胞质TDP-43池参与mRNA稳定性、运输和翻译的调控。TDP-43核质运输失调可导致胞质积累和聚集，伴随疾病状态下其正常核功能的丧失。病理性TDP-43蛋白高度磷酸化、多泛素化、被切割为C端35 kDa（TDP-35）和25 kDa（TDP-25）片段、蛋白半衰期延长，并被隔离至胞质中形成去垢剂不溶性胞质聚集体，分布于中枢神经系统包括海马、皮层和脊髓运动神经元。在FTLD-U和ALS患者中，TDP-43在泛素阳性不溶性聚集体内的积累暗示泛素蛋白酶体代谢级联受损参与TDP-43相关病理。已有研究证明，运动神经元特异性破坏蛋白酶体而非自噬，从根本上决定了ALS相关病理的进展，包括ALS标志性TDP-43聚集物形成和运动功能障碍，伴随进行性运动神经元丢失和胶质增生，从而提示增强蛋白酶体活性可能是ALS患者的有希望的治疗策略。在ALS的细胞和小鼠模型中，通过小分子吡唑啉酮增强蛋白酶体活性显示出显著的治疗效果，强烈证实了蛋白酶体作为ALS治疗靶点的潜在作用。然而，非选择性靶向特定底物的蛋白酶体激活可能导致不良副作用和复杂的细胞后果。因此，开发选择性恢复被病理性TDP-43破坏的蛋白酶体调控机制的方法，而非广泛激活整个蛋白酶体，可能最大限度地减少脱靶效应，为改善TDP-43蛋白病的病理标志提供更有效的途径。
**研究方法**
研究人员采用了以下关键技术方法：利用活细胞成像技术检测野生型与Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠原代皮层与运动神经元中MV151标记的20S蛋白酶体的轴突运输；通过免疫沉淀与荧光共振能量转移（FRET）显微镜分析TDP-43、TNKS与PI31之间的蛋白相互作用；采用RIPA/尿素序贯生化分级分离结合Western blotting与免疫荧光评估不溶性蛋白积累与共定位；利用天然凝胶电泳与20S蛋白酶体特异性荧光底物（Suc-LLVY-AMC）及活性探针MV151评估蛋白酶体组装与活性；通过半变性去垢剂琼脂糖凝胶电泳（SDD-AGE）检测TDP-43寡聚化与聚集。研究使用的Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠（B6.Cg-Tg(Prnp-TARDBP*A315T)95Balo/J，JAX stock no. 010700）购自Jackson Laboratory。
**研究结果**
**过表达TDP-43形成不溶性寡聚体、多聚体和聚集体，降低蛋白酶体活性并导致泛素化蛋白积累**
研究人员在N2a细胞中转染等量GFP对照、GFP标记的人野生型TDP-43全长（TDP-43-FL）、TDP-43-A315T或截短型TDP-25质粒，通过RIPA/尿素分级分离、SDD-AGE和免疫荧光分析。结果显示，GFP蛋白仅存在于RIPA可溶性组分中，呈弥漫性核质定位，无可检测的寡聚或多聚种类。野生型GFP-TDP-43-FL和突变型GFP-TDP-43-A315T主要积累于尿素不溶性组分中形成寡聚体，但仍主要位于核内，无显著胞质包涵体或聚集体。GFP-TDP-25则表现为RIPA可溶性组分水平降低、主要在不溶性尿素组分中积累为寡聚体，伴随显著的核周和胞质点状聚集体。20S蛋白酶体活性测定显示，表达GFP-TDP-43-A315T和GFP-TDP-25的细胞中内源性20S蛋白酶体活性显著受抑制。UbG76V-GFP报告底物实验进一步证实，过表达TDP-43-FL或TDP-25的NSC34细胞中UbG76V-GFP水平显著增加，以TDP-25表达细胞最为显著。此外，表达各TDP-43种类的细胞中内源性多泛素化蛋白水平显著增加。这些结果表明，不同溶解度的过表达TDP-43种类，无论仅以不溶性寡聚体形式存在还是形成胞质聚集体，均损害蛋白酶体活性，从而导致多泛素化蛋白积累和细胞蛋白稳态破坏，突出了寡聚型TDP-43种类在疾病进展中的致病意义。
**病理性TDP-43在细胞和Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠模型中均降低20S蛋白酶体活性**
研究人员检测了非转基因野生型对照与ALS模型Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠脊髓中的内源性20S蛋白酶体活性。结果显示，尽管在Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠脊髓中未观察到TDP-43聚集体，但典型的病理标志磷酸化TDP-43寡聚体和多聚体在疾病进展中显著检测到，以晚期水平最高，提示病理性TDP-43-A315T突变体主要以磷酸化寡聚体形式表达。与细胞模型结果一致，Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠中20S蛋白酶体活性较野生型同窝对照显著降低，而20S蛋白酶体和加载对照α-微管蛋白的表达水平组间相当。利用活性荧光探针MV151进一步分析显示，MV151特异性标记活性20S蛋白酶体的催化β1、β2和β5亚基，与GFP对照组相比，过表达GFP-TDP-43、GFP-TDP-43-A315T或GFP-TDP-25的细胞中MV151标记的20S蛋白酶体活性显著降低。综上，寡聚型TDP-43种类可能导致TDP-43过表达细胞模型和Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠中的蛋白酶体功能障碍和细胞蛋白稳态受损。
**过表达病理性TDP-43中断20S蛋白酶体的轴突运输**
神经元具有高度极化的形态，长轴突延伸远离胞体。除20S蛋白酶体活性外，维持局部蛋白稳态尤其依赖于蛋白酶体沿轴突向需要局部蛋白周转的细胞区室的适当运输。研究人员利用MV151标记内源性20S蛋白酶体，在DIV7原代皮层神经元中进行活细胞延时成像。结果显示，GFP和GFP-TDP-25蛋白在整个胞体和轴突中表达，GFP-TDP-25形成点状聚集体。延时成像显示MV151标记的内源性20S蛋白酶体在轴突内进行顺行和逆行运动。与GFP对照相比，转染GFP-TDP-25的原代皮层神经元中运动20S蛋白酶体的百分比显著降低，平均速度和净位移也显著下降。在表达GFP-TDP-43-FL的原代皮层神经元中也观察到类似的MV151标记20S蛋白酶体运动性损害。这些结果表明，截短型TDP-25和全长TDP-43的过度积累均破坏蛋白酶体沿轴突的运输。
**病理性TDP-43将TNKS隔离至不溶性组分，进一步减弱TNKS–PI31相互作用、PI31 ADP-核糖基化并损害19S/20S蛋白酶体组装**
鉴于TNKS–PI31相互作用和TNKS介导的PI31 ADP-核糖基化是19S–20S蛋白酶体组装及随后的26S蛋白酶体激活所必需的，研究人员进一步探究TDP-43是否通过干扰TNKS-PI31-ADP核糖基化信号通路破坏蛋白酶体功能。FRET实验显示，YFP-TNKS/CFP-TDP-43和YFP-TNKS/CFP-TDP-43-A315T均在胞质中表现出显著的FRETc信号和增加的FRETc倍数变化，表明TNKS主要在神经元胞质中与野生型和突变型TDP-43相互作用；YFP-TNKS/CFP-PI31也表现出强的胞质FRETc信号，表明TNKS在神经元胞质中也与PI31相互作用。免疫共沉淀实验显示，Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠脊髓组织中TNKS-PI31结合水平低于非转基因野生型对照，PI31 ADP-核糖基化水平也较野生型小鼠降低。免疫荧光共定位分析显示，Prp-TDP-43
A315T小鼠中内源性TNKS与病理性TDP-43共定位的百分比显著增加。RIPA/尿素分级分离显示，Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠尿素组分中不溶性TNKS和19S蛋白酶体亚基（包括PSMC6和PSMD4）水平显著高于非转基因对照。天然PAGE分析显示，Prp-TDP-43
A315T小鼠中结构完整的天然26S、20S和19S蛋白酶体复合物水平降低，19S和20S蛋白酶体亚基与26S蛋白酶体复合物的比值增加；凝胶内Suc-LLVY-AMC活性测定显示20S蛋白酶体活性减弱。此外，Prp-TDP-43
A315T小鼠运动神经元中TDP-43与MV151标记20S蛋白酶体的共定位增加。这些发现表明，病理性TDP-43将TNKS和部分蛋白酶体组分隔离至不溶性组分，从而减少TNKS与PI31相互作用的可利用性，并限制可溶性19S和20S亚复合物用于26S蛋白酶体组装。
**TDP-43-TNKS相互作用促进TNKS/PI31轴破坏和蛋白酶体功能障碍**
为进一步探究TDP-43-TNKS相互作用是否促进TNKS/PI31信号轴破坏和蛋白酶体功能障碍，研究人员构建了TDP-43突变体（TDP-43-TBD），在RRM1结构域的端锚聚合酶结合基序（RxxΦDG）中引入H166A和I168A替换以破坏其与TNKS的相互作用。RIPA/尿素分级分离显示，与TDP-43-FL相比，TDP-43-TBD主要积累于不溶性尿素组分并形成显著的胞质聚集体，但TDP-43-TBD转染细胞尿素不溶性组分中TNKS水平低于TDP-43-FL转染细胞。免疫共沉淀分析显示，与TDP-43-FL相比，TNKS与TDP-43-TBD之间的相互作用显著降低，伴随TNKS–PI31结合增加，提示TDP-43-TBD隔离TNKS的能力降低，从而允许更多的TNKS与PI31相互作用。20S蛋白酶体活性测定显示，尽管TDP-43-TBD比TDP-43-A315T更易形成不溶性聚集体，但TDP-43-TBD对20S蛋白酶体活性的损害不如TDP-43-A315T显著。这些结果表明，仅TDP-43聚集不足以破坏蛋白酶体功能；相反，TDP-43与TNKS之间的相互作用是TNKS隔离、TNKS/PI31信号轴损害及随后的蛋白酶体失活的重要贡献因素。
**TNKS酶活性对维持TDP-43神经病变中TNKS–PI31–20S蛋白酶体调控轴至关重要**
研究人员使用选择性TNKS抑制剂XAV939（一种细胞可渗透的选择性TNKS抑制剂，阻断TNKS介导的PI31 ADP-核糖基化）处理野生型和Prp-TDP-43
A315T小鼠来源的原代皮层神经元，分析PI31 ADP-核糖基化、PI31-20S蛋白酶体相互作用和蛋白酶体激活。结果显示，与DMSO对照相比，XAV939处理的野生型原代皮层神经元中PI31 ADP-核糖基化显著降低。在XAV939处理的野生型和Prp-TDP-43
A315T小鼠原代皮层神经元中，PI31与20S蛋白酶体的结合增加，26S蛋白酶体活性降低，重现了Prp-TDP-43
A315T小鼠中观察到的效应。此外，在转染病理性GFP-TDP-43-A315T或GFP-TDP-25并经XAV939处理的N2a或293T细胞中，尿素组分中不溶性TDP-43寡聚体和多聚体较DMSO处理对照增加。综上，XAV939抑制TNKS介导的PI31 ADP-核糖基化酶活性可在野生型和Prp-TDP-43
A315T皮层神经元中重现病理性TDP-43介导的TNKS/PI31/蛋白酶体调控轴破坏效应，导致TDP-43神经病变中更具毒性的寡聚型TDP-43形成。
**TNKS抑制重现病理性TDP-43介导的轴突20S蛋白酶体运输损害**
研究人员对DMSO或XAV939处理的非转基因野生型对照或Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠脊髓来源的E12.5原代运动神经元进行活细胞荧光延时成像，研究TNKS对MV151标记内源性20S蛋白酶体顺行或逆行运动动力学的影响。以CHAT作为运动神经元标志物，发现非转基因野生型对照和Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠中约60%的细胞为CHAT(+)运动神经元。结果显示，Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠运动神经元中蛋白酶体较非转基因野生型对照运动神经元动态性降低；在Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠运动神经元中，逆行和顺行方向的平均速度和净位移均呈显著下降趋势。与Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠类似，当非转基因野生型对照或Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠运动神经元中TNKS活性被XAV939抑制时，平均速度和净位移较DMSO处理也显著降低。此外，Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠原代运动神经元中运动20S蛋白酶体的百分比（36%）较非转基因野生型对照（57%）显著降低。在XAV939处理的非转基因野生型对照和Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠原代运动神经元中，运动20S蛋白酶体的百分比也降低（非转基因野生型对照43%，Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠38%）。值得注意的是，Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠中20S蛋白酶体逆行运动比例增加（59%），而非转基因野生型对照为47%。与DMSO处理的野生型（47%）相比，仅在XAV939处理的Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠原代运动神经元中观察到20S蛋白酶体逆行运动比例增加（68%），而XAV939处理的野生型小鼠中未见增加（46%）。综上，XAV939抑制TNKS活性可重现病理性TDP-43介导的Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠轴突20S蛋白酶体运动性降低，提示病理性TDP-43破坏TNKS/PI31依赖性蛋白酶体运输级联，从而加剧蛋白酶体功能障碍和蛋白清除受损。
**TNKS抑制重现病理性TDP-43诱导的TDP-43、PI31和蛋白酶体在运动神经元近端轴突中的积累**
为确定20S蛋白酶体功能障碍是否贡献于TDP-43亚细胞定位的改变，研究人员分析了原代运动神经元中TDP-43的空间分布。与先前发现类似，Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠运动神经元中TDP-43主要积累于胞体和近端轴突，而远端轴突中含量降低或几乎缺失。除TDP-43外，MV151标记的20S蛋白酶体在Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠中主要聚集于近端轴突（距胞体0–50 μm），而远端轴突（距胞体50–80 μm）中罕见。一致地，PI31也表现出近端轴突富集，且Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠运动轴突中PI31与MV151标记20S蛋白酶体共定位的比例较非转基因野生型对照显著增加。此外，XAV939抑制TNKS后，不仅在XAV939处理的非转基因野生型对照和Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠运动神经元中TDP-43显著积累于胞体和近端轴突，MV151标记的20S蛋白酶体和PI31也表现出显著积累；XAV939处理的非转基因野生型对照和Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠运动神经元中轴突PI31与MV151标记20S蛋白酶体共定位的百分比也较DMSO处理对照显著增加，类似于过表达病理性TDP-43-A315T突变体的Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠中观察到的分布。综上，病理性TDP-43破坏Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠中20S蛋白酶体运输，导致20S蛋白酶体、PI31和TDP-43在TDP-43神经病变运动神经元胞体和近端轴突中积累；而XAV939抑制TNKS活性可重现病理性TDP-43引起的蛋白酶体运输缺陷和蛋白稳态破坏。
**讨论与结论**
研究人员的研究结果强调了病理性TDP-43对蛋白酶体活性和轴突运输的有害影响，这两者都是ALS和FTLD等神经退行性疾病的核心。研究证明，过表达病理性寡聚型TDP-43（无论是野生型、A315T突变型还是截短型）均导致蛋白酶体活性显著降低，进而导致多泛素化蛋白积累。此外，研究提供了病理性TDP-43通过干扰TNKS/PI31信号轴影响蛋白酶体轴突运输的全面图景。原代皮层或运动神经元的活细胞成像显示，TDP-43过表达破坏20S蛋白酶体在轴突内的运动，降低其速度和净位移，提示TDP-43损害蛋白酶体向适当亚细胞区室的运输，而这对维持局部蛋白稳态和清除受损蛋白至关重要。蛋白酶体运输抑制导致轴突中有毒蛋白聚集体清除失败，这是ALS的特征，最终导致神经元功能障碍。
在生理条件下，TNKS介导的PI31 ADP-核糖基化降低PI31对20S核心颗粒的亲和力，同时促进其与伴侣蛋白p27和S5b的相互作用，从而促进20S蛋白酶体从抑制性PI31结合中释放，促进20S核心与19S调节颗粒组装形成活性26S蛋白酶体。在轴突运输过程中，PI31作为衔接蛋白将20S蛋白酶体连接至动力蛋白马达复合物，促进基于微管的运输。到达适当亚细胞区室后，TNKS介导的PI31 ADP-核糖基化可能促进20S蛋白酶体从PI31释放，允许局部26S蛋白酶体组装。在TDP-43相关神经病理中，过量或错误折叠的TDP-43异常结合TNKS并将其隔离至不溶性聚集体中，减少功能性TNKS与PI31相互作用的可利用性，导致TNKS介导的PI31 ADP-核糖基化降低。因此，PI31与20S蛋白酶体结合更紧密，而19S调节颗粒可能仍与p27和S5b等伴侣蛋白结合，从而损害19S/20S组装。TNKS介导的PI31调控缺陷可能导致蛋白酶体运输和局部蛋白酶体组装受损，减少蛋白水解能力，促进错误折叠和泛素化蛋白积累，最终导致蛋白毒性应激和神经元功能障碍。
研究还讨论了TDP-43寡聚化、逆行运输比例增加的潜在代偿意义、TNKS1/2与McGurk等先前发现的关系（病理性TDP-43作为上游隔离并功能性失活TNKS，而非TNKS作为主要驱动因素捕获TDP-43），以及TDP-43是否作为TNKS的ADP-核糖基化底物等未解问题。研究指出细胞模型和Prp-TDP-43
A315T转基因小鼠不能完全重现人类ALS和FTLD的遗传、细胞和病理异质性，未来使用患者来源的神经元系统（如iPSC运动神经元）和设计选择性调节TDP-43–TNKS相互作用的肽类将有助于进一步验证该通路。
研究结论为：研究人员鉴定了一个功能性TNKS/PI31/20S蛋白酶体轴，该轴参与蛋白酶体活性和轴突运输的调控，对TDP-43清除和神经元蛋白稳态具有重要意义。在生理条件下，TNKS介导的PI31 ADP-核糖基化支持蛋白酶体组装并参与调控沿轴突的双向蛋白酶体运输。在病理条件下，过量TDP-43将TNKS隔离至不溶性复合物中，减少其与PI31的相互作用并损害PI31 ADP-核糖基化、蛋白酶体组装和蛋白酶体运输，从而促进蛋白积累。研究结果表明，TNKS酶活性不仅参与蛋白酶体激活，也参与高效的轴突蛋白酶体运输。使用XAV939药理学抑制TNKS可重现TDP-43模型（包括表达截短型TDP-25或TDP-43-A315T的模型）中观察到的关键特征，导致PI31 ADP-核糖基化降低、19S–20S蛋白酶体组装受损和26S蛋白酶体活性降低。这种破坏伴随蛋白酶体运输缺陷，包括速度、净位移和运动性降低，以及20S蛋白酶体和PI31在胞体和近端轴突中的积累。重要的是，研究结果表明调节TNKS/TDP-43相互作用可能是保持TNKS/PI31信号和蛋白酶体功能、从而支持病理性TDP-43清除的潜在治疗策略。综上，这些发现将TNKS/PI31/蛋白酶体轴确定为TDP-43相关神经退行性疾病的潜在治疗靶点。
