《Journal of Chromatography A》：Comprehensive and rapid analysis of shea butter extracts by supercritical fluid chromatography-charged aerosol detection-ion mobility high-resolution mass spectrometry
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研究人员开发并验证了一种超临界流体色谱-荷电气溶胶检测-捕集离子淌度飞行时间质谱（SFC-CAD-timsTOF）方法，用于以乳木果油提取物为应用示例的植物油分析。该方法采用两根极性二乙胺（DEA）色谱柱串联，在低洗脱强度条件下于17 min内实现三酰甘油（T
研究人员开发并验证了一种超临界流体色谱-荷电气溶胶检测-捕集离子淌度飞行时间质谱（SFC-CAD-timsTOF）方法，用于以乳木果油提取物为应用示例的植物油分析。该方法采用两根极性二乙胺（DEA）色谱柱串联，在低洗脱强度条件下于17 min内实现三酰甘油（TG）、1,3-二酰甘油（1,3-DG）、1,2-二酰甘油（1,2-DG）、单酰甘油（MG）、游离脂肪酸（FA）及部分不皂化物的类别分离。捕集离子淌度（IM）与高分辨质谱（HRMS）的联用提供了各类别内物种的综合鉴定，共鉴定出57个特征。信号均匀性实验表明，在蒸发温度25°C、功率函数值（PFV）为1及多项式回归条件下，同类物种的响应因子（RF）无显著差异，从而可实现每类单一代表性标准品的定量，大幅减少对多种参考化合物的需求。该方法的日内与中间精密度及定量限（LOQ）符合验证指南要求，但与参考方法相比，主要化合物类别的定量存在轻微偏差。该方法为乳木果油提取物提供了快速、综合的定性与定量分析，较现有方法更省时省资源，废物产生更少且所需试剂毒性更低。
研究背景：植物油作为多功能可再生资源，在食品、化妆品和护肤等行业中具有重要应用价值，其价值也体现在全球产量从2001年至2024年增长近2.5倍。植物油主要由三酰甘油（TG）组成，并含有少量二酰甘油（DG）、单酰甘油（MG）、游离脂肪酸（FA）及不皂化物（包括甾醇、生育酚和三萜酯等）。除化合物类别多样且比例各异外，每类还包含在链长、双键数、位置异构、立体异构和区域异构等方面不同的多种物种。植物油组成强烈影响其性质、质量和商业价值，因此准确高效的分析方法对区分高低品质油脂至关重要。目前标准化方法（如HPLC-RID测定TG组成、高温尺寸排阻色谱-RID测定主要化合物类别、GC-FID测定甾醇含量）虽提供一致性和可靠性，但往往耗时、可能需要衍生化，且不能单独提供全面的化学轮廓，通常需要多种互补方法，涉及大量有机溶剂使用。超临界流体色谱（SFC）因以超临界CO?为主要流动相，被认为比液相色谱（LC）更环境友好，具有低粘度和高扩散性，可在更高流速和更短分析时间内实现类似效率。然而，据研究人员所知，此前尚未尝试使用极性SFC柱和低洗脱强度条件分离植物油中的化合物类别。此外，质谱定量因响应因子差异和离子抑制而具有挑战性，而荷电气溶胶检测（CAD）提供宽动态范围和相对均匀的响应，可实现每类单一标准品定量。本研究旨在开发和验证SFC-CAD-IM-HRMS方法，以乳木果油提取物为应用示例，实现快速化合物类别分离、每类单一标准品定量及类别内物种鉴定。
研究人员开展的研究：研究人员开发了SFC-CAD-timsTOF方法，采用两根Waters Torus DEA柱（1.7 μm，3 mm × 100 mm）串联，以超临界CO?为流动相A、甲醇为流动相B、含0.1%甲酸铵的甲醇为补料溶剂，梯度洗脱，运行时间17 min。CAD蒸发温度设为25°C、PFV为1.0。timsTOF在PASEF扫描模式下采集，正负ESI模式分析。方法验证评估了日内和中间精密度、定量限和偏差，并与AOCS Ce 5b-89和ISO 18395:2005标准方法比较。结论：该方法可在17 min内实现乳木果油提取物主要化合物类别的类别分离，IM和HRMS联用提供各类别内物种的综合鉴定，信号均匀性实验证明在优化条件下同类物种RF无显著差异，可实现每类单一代表性标准品定量。方法精密度和定量限符合验证指南，但主要类别定量与参考方法相比存在轻微偏差。该方法较现有方法更省时省资源，废物更少且试剂毒性更低，为乳木果油提取物提供快速综合的定性和定量分析。
关键技术方法：研究采用超临界流体色谱（SFC）以超临界CO?为流动相，两根极性二乙胺（DEA）柱串联实现类别分离；荷电气溶胶检测（CAD）用于定量，通过优化蒸发温度和功率函数值（PFV）实现响应因子均匀化；捕集离子淌度飞行时间质谱（timsTOF）提供精确质量、同位素模式、碎片模式和碰撞截面（CCS）值，结合PASEF扫描模式采集数据；采用脂质注释工具、SmartFormula和MetFrag等三种注释策略进行物种鉴定；使用AGREE工具评估方法绿色度。乳木果油提取物样品由AAK Denmark（Aarhus, Denmark）提供。
研究结果：
3.1 方法开发策略：乳木果油提取物中化合物类别极性低且相近，需低洗脱强度条件获得足够保留；各类别浓度差异大，需优先分离高丰度与低丰度类别。初始柱和梯度筛选表明，DEA柱在2%/min梯度斜率下给出较宽的保留时间窗口，且TG与其他类别达到基线分离，故选择DEA柱进一步优化。SFC方法参数优化中，两根DEA柱串联使九类中七类达到基线分离；仅用甲醇作改性剂改变了MG和FA的洗脱顺序，使FA最后洗脱，避免了FA峰尾遮蔽MG的风险；提高背压、流速和降低柱温可增强TG与三萜醇的分离。最终SFC方法在11 min内洗脱所有类别，1,3-DG与α-生育酚共洗脱被视为可接受折衷。
3.2 CAD参数调优：8类中5类的信噪比随蒸发温度升高而降低，FA和MG最明显，因其挥发性较高导致干燥管中气化损失；低挥发性类别（TG和DG）信噪比未变或升高。为保持响应因子均匀性，选择最低蒸发温度25°C。PFV从1.8降至1.0以避免功率变换放大峰面积微小差异而损害信号均匀性。
3.3 响应因子均匀性评估与类别代表性标准品选择：比较线性、多项式和双对数变换后线性三种回归策略，线性回归仅24个分析物中16个相关系数>0.99，多数类别RF不均匀，挥发性类别变异性最大；三硬脂酸甘油酯响应较低且多变，可能因长链饱和TG在CO?膨胀后溶解度降低导致部分沉淀。多项式回归和双对数变换改善了多数类别的RF均匀性，多项式回归因相关系数普遍较高而被选用。根据典型乳木果油提取物中各类别预期最高含量选择代表性标准品。
3.4 方法验证：精密度方面，所有日内RSD低于6%、中间精密度低于15%，符合验证指南；标准混合物日内重复性1.7-2.9%，乳木果油提取物中多数类别中间精密度良好，接近定量限的类别中间RSD较高。定量限方面，所有类别在10 μg/mL以上RSD<5%，符合预设20 μg/mL的适用性标准；不皂化物因含量低未测定LOQ；本方法LOQ较此前CAD方法高1-5倍，归因于较低蒸发温度和较低PFV。偏差方面，TG浓度略高于ISO 18395:2005参考方法，可能因与三萜酯部分共洗脱（MS数据确认），配对t检验仍表明无显著差异但p值接近0.05；DG无显著差异；MG和FFA测定值低于参考方法。
3.5 乳木果油提取物综合表征：正负ESI模式分析结合三种注释策略鉴定出57个特征，其中52个注释至物种或分子物种水平。22个特征 assigned为TG，与AAK Denmark标准AOCS方法获得的TG列表比较显示大多数TG物种一致，最高强度为TG 18:0_18:1_18:1和TG 18:0_18:0_18:1，表明含硬脂酸和油酸物种高丰度；21个DG物种含16:0、18:0、18:1和18:2酰链不同组合，1,2-和1,3-DG通过保留时间差异区分；3个MG分子物种鉴定但酰链位置未知；6个FA特征注释。Kendrick质量亏损图支持TG、DG、MG和FA的鉴定。5个特征（化合物T1-T5）仅注释至类别水平，高分候选物主要为三萜和三萜类结构，T1-T3精确质量相同但CCS不同表明为异构体，候选结构多为C30烃类包括角鲨烯；T4和T5高分候选物主要为不同三萜乙酸酯异构体。
3.6 绿色度评估：AGREE工具评估显示 developed和参考方法得分分别为0.45和0.42，总体绿色度相近且中等。 developed方法在废物产生、每次运行分析物数量、样品通量、可再生来源试剂使用和低毒性试剂使用等标准上优于参考方法；参考方法在能耗和操作安全性上更优，后者主要因样品稀释剂中使用庚烷，以THF替代庚烷可改善该标准得分。
讨论部分总结：该方法 limitations包括对含高水平长链饱和酰基TG的样品性能降低，以及需对单一样品多次稀释以确保所有脂质类别落入各自校准范围；前者对乳木果油提取物分析不构成问题，因这些TG物种含量低；后者未来可通过建立类别特异性校准范围解决，但需验证修订浓度范围内的RF均匀性。尽管如此，所提方法较现有方法更省时省资源，废物更少且试剂毒性更低，同时提供乳木果油提取物的快速综合定性和定量分析。
研究结论翻译：所开发的SFC-CAD-timsTOF方法可在17分钟内实现乳木果油提取物中主要化合物类别（包括TG、1,3-和1,2-DG、MG、FA及部分不皂化物）的类别分离。这是通过串联两根DEA柱并应用低初始流动相洗脱强度实现的。IM和HRMS的整合提供了各类别内物种的综合鉴定。信号均匀性实验表明，在使用25°C蒸发温度、PFV为1和多项式回归时，同类物种的RF无显著差异，从而可实现每类单一代表性标准品定量，大幅减少对多种参考化合物的需求。方法日内和日间精密度及定量限符合验证指南要求，但与参考方法相比，主要化合物类别定量存在轻微偏差。方法局限性包括对含高水平饱和长链酰基TG样品的性能降低，以及需对单一样品多次稀释以确保所有脂质类别落入各自校准范围；前者对乳木果油提取物分析不构成问题，因这些TG物种含量低；后者未来可通过建立类别特异性校准范围解决，但需验证修订浓度范围内的RF均匀性。尽管如此，所提方法较现有方法更省时省资源，废物更少且试剂毒性更低，同时提供乳木果油提取物的快速综合定性和定量分析。
