《Journal of Chromatography B》：Clinical amyloid subtyping from FFPE biopsies using a rapid preparation workflow and high-flow LC-Q Exactive MS
编辑推荐：
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开发了一种快速的日流程方法，用于FFPE（福尔马林固定、石蜡包埋）组织的淀粉样蛋白亚型鉴定。
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开发了一种快速的日流程方法，用于FFPE（福尔马林固定、石蜡包埋）组织的淀粉样蛋白亚型鉴定。
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高流速LC-MS/MS技术减少了分析时间和仪器维护成本。
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热辅助提取和快速消化可在6小时内完成样品制备。
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高流速LC-MS/MS能够准确识别主要的淀粉样蛋白亚型。
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该流程减少了临床检测的周转时间、劳动强度和总体成本。
引言
淀粉样变性是一组以组织 and 器官中不溶性蛋白质纤维沉积为特征的疾病 [1]。通过刚果红染色可以在组织学上识别淀粉样沉积物，这种染色在偏振光显微镜下会产生特有的苹果绿色双折射现象。淀粉样变性可以影响多个器官，尤其是心脏、肾脏、肝脏以及周围神经系统和自主神经系统。主要的淀粉样蛋白类型包括免疫球蛋白轻链（AL）淀粉样变性、转甲状腺素（TTR）淀粉样变性和血清淀粉样蛋白A（AA）淀粉样变性 [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]。
准确的淀粉样蛋白亚型鉴定至关重要，因为不同亚型在发病机制、临床过程、预后和治疗方面存在显著差异 [9], [10]。尽管免疫组化和免疫荧光常用于淀粉样蛋白亚型鉴定，但这些方法可能受到抗体可用性、非特异性背景染色、血清蛋白污染和目标表位丢失的影响 [11], [12]。
激光显微解剖（LMD）结合液相色谱质谱（LC-MS）的蛋白质组学技术已成为FFPE组织中淀粉样蛋白亚型鉴定的可靠方法 [13], [14]。LMD能够选择性地分离出刚果红阳性的淀粉样沉积物，而基于MS的蛋白质鉴定技术可以敏感地分析这些淀粉样蛋白 [15], [16], [17], [18]。然而，传统的流程（表1）可能需要具有较长运行时间的纳流液体色谱（nano LC）、繁琐的样品制备和长时间的酶消化，从而导致操作时间增加和报告延迟 [19]。除了传统的显微解剖技术外，淀粉样蛋白组学的领域还扩展到了新的原位标记策略。最近的创新包括使用专用的Thioflavin T配置进行结构组织成像 [20]，以及基于刚果红的光化学传感器 [21] 来从周围组织中分离目标淀粉样蛋白组。虽然这些基于邻近性的平台主要用于空间发现和结构分析，但本研究重点评估了一种适用于标准临床工作流程的高流速液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）协议。因此，开发出一种能够快速进行组织制备和高流速LC-MS/MS分析的简化流程对于临床应用非常有用。
在本研究中，我们开发并验证了一种快速的高流速UHPLC-MS/MS方法，用于从LMD分离出的FFPE组织中进行淀粉样蛋白亚型鉴定。该流程结合了热辅助组织制备和短时间的Trypsin/Lys-C消化，将酶消化时间缩短至当天完成。高流速UHPLC-MS/MS分析的色谱运行时间为28分钟。该方法在分析性能、稳健性和重复性方面得到了全面验证，并随后被作为经过CLIA认证的实验室自开发测试（LDT）实施。
部分简介
化学品和试剂
所有化学品均为分析级、LC-MS级或质谱级，无需进一步纯化即可使用。LC-MS级的水、甲醇、乙腈、甲酸、盐酸、乙酸、二甲基亚砜（DMSO）和乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）均购自Fisher Scientific（美国新罕布什尔州汉普顿）。三氟乙酸（TFA）、三（2-羧基乙基）膦盐酸盐（TCEP-HCl）和Chloroacetamide也用于实验。
高流速LC-MS/MS方法的开发
为了建立一种稳健且可重复的高流速LC-MS/MS流程，用于从LMD组织中鉴定淀粉样蛋白，我们使用了Pierce Peptide Retention Time Calibration Mixture（PPRCM）来优化色谱和质谱条件。PPRCM包含15种稳定同位素标记的合成肽，覆盖了广泛的疏水性范围。该混合物广泛用于评估bottom-up蛋白质组学中的LC-MS/MS性能 [30], [31]。
一个10 μL的注射液中包含500...
讨论
在本研究中，我们开发并分析了从LMD FFPE组织中进行淀粉样蛋白亚型鉴定的快速高流速LC-MS/MS流程。该流程结合了标准化的LMD组织输入、热辅助蛋白提取、短时间的Trypsin/Lys-C消化以及28分钟的LC-MS/MS梯度分析。整个样品制备过程可在大约6小时内完成，从而实现当天的分析。
结论
我们的高流速LC-MS/MS方法成功地从患有各种类型临床淀粉样变性的患者的FFPE组织样本中鉴定了TTR、AL-K和AL-L淀粉样蛋白亚型。我们证明，这种短梯度LC-MS/MS流程得到的结果与参考实验室的结果相当。该方法简单、稳健，易于在临床质谱实验室中实施。此外，我们还通过优化样品制备流程提高了...
作者贡献声明
Naga Veera Yerra：撰写——初稿，概念构思；Srinivas Chakravartula、Coryn Gonis、Zead Elzoeiry、Aadhya Agarwal、Mohammad Zuber Nakadar、Thomas Hansen、Carlos Cordon-Cardo：撰写——审阅与编辑；Damodara Rao Mendu：监督与研究指导。
资助
本研究未获得任何公共、商业或非营利机构的资助。
作者声明没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
作者衷心感谢Mount Sinai医院的临床化学部门为这项工作提供的设施和财务支持。
