一种快速稳健的人血浆中循环色氨酸衍生吲哚-3类代谢物定量生物分析方法的建立与验证

《Journal of Chromatography B》：Rapid and robust bioanalytical assay for the quantification of circulating tryptophan-derived indole-3 metabolites in human plasma

　　

色氨酸（tryptophan）作为一种必需氨基酸，其代谢产物与短链脂肪酸（SCFA）及肝源性胆汁酸共同构成肠道微生物群研究最深入的三类微生物产物。色氨酸主要有三条代谢途径：血清素途径与犬尿氨酸（kynurenine）途径主要存在于真核生物，而细菌性吲哚-3途径则生成吲哚-3-乙酸（IAA）、吲哚-3-丙酸（IPA）、吲哚-3-甲醛（ICA）及DL-吲哚-3-乳酸（ILA）等化合物。近期AbuSalim等报道IAA与ILA亦可由小鼠及人类患者宿主自身产生。随着微生物组研究的兴起，对高灵敏度定量细菌代谢物的方法需求日益增长。研究发现肠道微生物群存在较大个体间差异，仅约5%的肠道细菌为共有，由此提出生态系统存在冗余性、功能（如代谢）输出在人群间可能更为相似的假设。临床前研究显示，源自肠道的IPA在体内循环并抑制肺及脑等远端部位的炎症反应；相反，血浆基线IAA水平与未来因肺炎住院风险增加相关。这些实例凸显了建立简便、准确量化吲哚-3类代谢物系统水平方法的必要性。 目前已报道众多定量色氨酸代谢物（含一种或多种吲哚-3类代谢物）的生物分析方法，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）已成为该领域的首选方法。LC-MS/MS方法已实现啮齿类动物、人类、细胞培养及细菌等不同基质（脑、脑脊液、粪便、血浆、血清、唾液）中吲哚-3类代谢物的定量。IAA与IPA在这些特定方法中常被测定，其他吲哚-3类代谢物或不超过三种代谢物的组合报道较少。IAA亦曾与N,N-二甲基色胺及其代谢物、慢性肾病相关代谢物（尤其蛋白结合型尿毒症毒素，PBUTs）联合在人血浆中经LC-MS/MS定量。近期报道的吲哚-3类代谢物生物分析方法均未采用96孔板格式进行高通量样品处理。此外，已报道多种植物中IAA与众多其他化合物联合定量的LC-MS/MS方法。所有LC-MS/MS研究者均使用电喷雾电离（ESI），仅Cao等额外比较了ESI与大气压化学电离（APCI）及大气压光电离（APPI）。高分辨MS/MS仅被Lefevre等使用。曾有采用LC-荧光检测报道IAA、IPA、ICA、ILA及其他吲哚类物质的生物分析方法，但ICA无法在人血浆中检出，且该方法仅进行了有限验证。最后，吲哚-3类代谢物已被纳入近期范围更广的靶向代谢组学血浆检测中，可能同时包含IAA、IPA、ICA与ILA。这些代谢组学方法通常较根据现行FDA与EMA指南验证的专用方法精密度与准确度更低、成本更高。此外，这些代谢组学方法均报道了相对繁琐的样品前处理、提取、衍生化及额外离心，或标准品溶液蒸干与标准加入方案。因此，研究人员开发并验证了一种新的、相对快速、简便且足够灵敏的LC-MS/MS方法，以96孔格式定量人血浆中吲哚-3类代谢物IAA、IPA、ICA与ILA。

研究背景方面，色氨酸代谢产物是肠道微生物群研究的重要对象，吲哚-3类代谢物（IAA、IPA、ICA、ILA）与炎症调节、肺炎住院风险、2型糖尿病、高血压、心力衰竭、抑郁样行为、肠道炎症及主动脉夹层等多种生理病理过程相关，因此需要简便、准确且灵敏的定量方法。现有问题在于：已报道的LC-MS/MS方法多仅覆盖IAA和IPA或不超过三种吲哚类代谢物，缺乏96孔板高通量样品处理格式；代谢组学方法虽覆盖较广，但精密度与准确度较低、成本较高且前处理繁琐（提取、衍生化、额外离心或蒸干、标准加入等）；LC-荧光法无法在人血浆中检出ICA且验证有限。基于此，研究人员开发并验证了一种快速、简便、灵敏的LC-MS/MS方法，以96孔格式定量人血浆中的IAA、IPA、ICA与ILA，并采用替代基质解决内源性存在导致的校准难题。

关键技术方法概述（不超过250字）：研究采用Acquity UPLC? BEH C18柱（30×2.1 mm，d_p=1.7 μm）与Nexera-X2色谱系统进行梯度洗脱分离，流动相为0.1%（v/v）甲酸水溶液与甲醇；采用AB Sciex QTRAP? 5500三重四极杆质谱仪，以正离子模式选择反应监测（SRM）检测，并使用稳定同位素标记（SIL）内标（IAA-d₅、IPA-d₂、ICA-¹³C₈、ILA-d₅）。样品前处理为乙腈蛋白沉淀的96孔板格式。校准与验证采用75%磷酸盐缓冲液（PBS）与25%甲醇组成的替代基质。验证参照FDA与EMA指南并因内源性存在而修改，涵盖校准、准确度与精密度、选择性、回收率与基质效应、稳定性及实测样品再分析（ISR）。人锂肝素血浆来自Sera Laboratories（混合性别池化及个体样本），红细胞来自Sanquin Bloedbank。

研究结果方面：

3.1 方法开发：样品处理、色谱分离与质谱检测经优化以获得灵敏、精密、准确且快速的定量方法，四种化合物均可商购SIL内标。采用乙腈（人血浆最有效沉淀溶剂）的96孔板蛋白沉淀法被证明快速高效且血浆回收率高。由于人血浆中吲哚-3类代谢物内源性存在，最低水平的校准与验证需采用替代基质；多数混合血浆批次代谢物水平与个体样本相近，但两个血浆池IAA水平高得多（约1 μg/ml），故未纳入加标血浆低水平验证实验。牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液（4%，m/v）作为替代基质首选被测试，但该基质含可检出水平的所有四种代谢物，IAA、IPA、ILA超过LLOQ的20%，ICA甚至超过LLOQ，故筛选了三批替代BSA与鸡白蛋白，虽找到IAA、IPA、ILA较低批次，但所有白蛋白批次ICA水平仍较高（5–8 ng/ml），因此评估了基于甲醇和/或PBS的替代基质。采用短通用反相（RP）柱梯度洗脱实现快速分离并保持足够保留与分离度；0.1%（v/v）甲酸与甲醇流动相仅对血浆有机蛋白沉淀提取物产生温和电离效应，以0.2%（v/v）乙酸替代甲酸或以乙腈替代甲醇均未改善四种吲哚的质谱响应。SRM参数经优化，IAA与IPA均产生喹啉离子（m/z 130）为主要产物；因ILA质谱响应最低，无法单独优化的仪器参数以ILA优化；为提高灵敏度，ILA两个通道加和用于定量；为保持在校准范围内并避免电子倍增器饱和，校准范围、前处理程序、进样体积与内标量经预试验后选定；IPA-d₂浓度经仔细优化以限制目标物与该SIL内标间的双向干扰（该化合物无更重SIL替代品）；IAA选用低于最优的碰撞能量以改善最高范围校准线性；ICA采用第二丰度产物离子（m/z 91）而非第一丰度（m/z 118）定量，以改善校准（减小截距）、精密度与背景噪声。

3.2.1 校准：优化后IAA与ICA响应均显示轻微非线性偏离，故两者采用二次回归定量，二次项均显著偏离零（p值分别为0.043与0.010，单尾t检验，n=7）。7次校准的各浓度水平精密度与准确度及校准方程参数显示，决定系数均相近，斜率变异小，所有截距不显著；ICA响应小所致截距可见于空白与双空白样本，且在LLOQ的20%以内，符合接受标准。

3.2.2 准确度与精密度：替代基质与血浆结果均满足现行指南要求，甚至包括血浆中最低加标水平。因IAA与IPA水平可能接近定量上限（ULOQ），进行了稀释完整性实验，准确度与精密度（IAA/IPA）分别为107.5%/106.7%与1.8%/1.4%，保证了两者高于ULOQ的定量。

3.2.3 选择性：所评估血浆样本（n=6）中四种稳定同位素标记内标均未检出干扰峰；基于每种分析物三个SRM通道监测比值的相对离子比与参考样本比较，观察比值范围为95.7%至101%，证实无显著基质相关干扰。模拟溶血血浆影响ICA水平测定，而IAA、IPA与ILA水平不受影响，这仅能部分由红细胞中存在该化合物解释；模拟脂血血浆不影响任何代谢物测定。

3.2.4 回收率与基质效应：因血浆中内源性吲哚-3类代谢物水平使低QC水平（7–5–30 ng/ml）无法可靠评估，故未在低QC水平评价回收率与基质效应。混合血浆中回收率与基质效应结果显示，所有分析物回收率与基质效应均可接受，仅ILA回收率略有升高；回收率与基质效应变异性大多较低，进一步支持样品前处理程序的稳健性。不同血浆批次的绝对（97.0–103.3%）与相对（89.9–102.1%）基质效应结果亦在可接受范围。

3.2.5 稳定性：QC样品在所考察条件下保持稳定，吲哚-3类代谢物平均回收率为87.2%至108.6%；两个个体血浆批次短期稳定性（室温23 h）亦获确认，平均回收率98.6%至113.7%（均n=4）。处理后的血浆提取物在4 °C自动进样器中至少稳定一周，5个QC样品中各化合物一周后平均偏差为?13.9%至7.2%。储备液（水中，各化合物n=2）在?30 °C下稳定20周，四种化合物平均回收率101.3%至103.1%。

3.2.6 实测样品再分析与初步研究：六份人血浆样品双份分析显示所有分析物差异在±20%以内，表明方法重现性良好，尽管样本数有限。平均浓度按ICA < IPA < ILA < IAA顺序从7.5增至221 ng/ml，个体间变异按ICA < IAA ≈ ILA < IPA顺序从24%至81%。检出水平与许多早期检出浓度处于相同范围，尽管后续亦发现更高水平。总体表明该方法适用于人锂肝素血浆中四种代谢物的定量，6份样品中仅1份IPA浓度略低于LLOQ。样品再储存8个月后第三次分析显示20%范围外仅1个ILA浓度，可能保证在已报道稳定性之外的长期稳定性。校准范围经选择以涵盖健康与疾病受试者已报道的循环吲哚浓度；对所有这些吲哚，健康成人已报道血浆浓度均远低于ULOQ。IAA水平接近该上限（4000 ng/ml）的情况见于终末期慢性肾病尿毒症状况及给予N,N-二甲基色胺后；超过ULOQ的水平不太可能且迄今未见报道。除作为肾病标志物外，IAA亦是预测动脉粥样硬化结局的关键代谢物；反之，系统性ILA、IPA或ICA血浆水平降低可具临床相关性：IPA水平与2型糖尿病发病呈负相关，并介导高血压与心力衰竭；因IPA仅为微生物来源代谢物，抗生素使用可使其降至不可检出水平（<5 ng/ml）；ICA被认识可调节健康结局，包括抑郁样行为、应激易感性、肠道炎症及主动脉夹层；ILA亦被证明在生命早期及肿瘤环境中调节免疫应答。

讨论与结论总结：研究人员开发并成功验证了一种针对四种色氨酸衍生吲哚-3类代谢物的新型生物分析LC-MS/MS方法。采用替代基质方法的验证结果满足现行指南要求。该新方法适用于全谱肾功能，包括晚期慢性肾病与终末期肾病，亦适用于健康、代谢、胃肠及营养干预队列。此外，代谢物的长期稳定性支持该方法用于储存（临床）血浆样本分析。通过聚焦四种吲哚-3衍生物、简便样品前处理及96孔板格式，研究人员开发并验证了一种相对快速、简便的生物分析方法，可用于进一步临床研究。研究结论翻译：研究人员开发并成功验证了一种用于四种色氨酸衍生吲哚-3类代谢物的新型生物分析LC-MS/MS方法；采用替代基质方法的验证结果符合现行指南；该新方法适用于全谱肾功能（包括晚期慢性肾病与终末期肾病）以及健康、代谢、胃肠和营养干预队列；代谢物的长期稳定性支持该方法适用于储存（临床）血浆样本分析；通过聚焦四种吲哚-3衍生物、简便样品前处理和96孔板格式，研究人员开发并验证了一种相对快速、简便的生物分析方法，可供进一步临床研究使用。