高孔隙率电纺PHBV压电纤维构建体通过内禀机电耦合促进肌肉再生

《Small》：Three-Dimensional Piezoelectric Fibrous Constructs for Muscle Regeneration

　　

聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)(PHBV)是一种具有内禀压电性的生物相容且可生物降解的聚合物，有望用于开发组织再生的仿生支架。其响应机械刺激产生电荷的能力可模拟肌肉等天然组织中的机电环境，因而具有吸引力。本研究聚焦于利用PHBV特性设计用于肌肉再生的电纺纤维支架。研究人员考察了溶剂组合、聚合物浓度及针尖-收集器距离等加工参数对纤维形貌、孔隙率及压电性能的影响。研究人员观察到，对于孔隙率受控的支架，准静态压电系数(d₃₃从0.117增至2.9 pC/N)提高了25倍。该压电活性经动态矢量网络分析仪(VNA)测量得到证实，其机电耦合系数(k_t)为13.69%。这种增强的机电响应凸显了其刺激细胞响应以促进组织再生的潜力。这些支架的力学性能表明其能够承受高达40%的应变，处于肌肉组织工程的最佳范围内并与肌肉功能相容。PHBV支架的细胞相容性得到确认，初步研究表明其具有支持肌原性分化的潜力。本研究凸显了基于PHBV的仿生支架用于肌肉再生的潜力，并为开发应对肌肉损伤和疾病的先进疗法奠定了基础。

严重骨骼肌损伤导致的容积性肌肉丢失(VML)因成年骨骼肌再生能力有限而成为重大临床挑战，现有自体肌肉移植受供区并发症及纤维随机取向所致整合不佳等限制。三维纤维压电支架(FPS)因兼具结构支撑与模拟天然肌肉机电环境的电刺激而成为潜在替代方案。PHBV作为聚羟基烷酸酯(PHA)家族成员，兼具生物可降解性、生物相容性与内禀压电性(纵向d₃₃为2–5 pC/N，横向d₃₁为0.5–2 pC/N)，其体内降解产物代谢相容，但PHBV内禀压电性对骨骼肌再生的贡献尚不明确：既往PHB基电纺纤维研究多将其作为生物相容性基底而未直接考察机电活性，PHBV压电响应主要针对骨再生研究，而肌肉领域压电线索多通过分散于不可降解基质中的钛酸钡等陶瓷纳米颗粒引入；且现有增强PHBV纤维功能策略常需引入额外聚合物、纳米结构或后处理，增加了生产复杂性与临床转化顾虑，并难以将生物学响应归因于PHBV自身压电性。为此，研究人员仅通过电纺参数调控无添加剂PHBV纤维的机电响应，以针尖-收集器距离控制纤维形貌与孔隙率进而调控有效压电系数，再将纤维卷绕成用于肌肉再生的三维圆柱构建体；为检验该内禀压电性是否促进肌原性分化，将PHBV支架与形貌匹配、经同等层粘连蛋白(LM)涂覆的非压电PCL支架在静态培养(用有限元建模估算细胞收缩产生的电位)与纳米振动机械刺激条件下进行比较。该研究发表于《Small》，其意义在于建立了可生物降解聚合物内禀压电性与肌原性分化之间的联系，为修复容积性肌肉丢失的支架研究奠定基础。

研究人员采用的关键技术方法包括：采用电纺技术(通过沟槽收集器实现纤维取向排列)制备PHBV纤维并以PCL为阴性对照；采用扫描电镜(SEM)、微计算机断层扫描(MicroCT)表征纤维形貌与孔隙率；采用Berlincourt d₃₃仪与矢量网络分析仪(VNA)共振法两种独立技术表征压电系数与机电耦合系数；采用COMSOL Multiphysics有限元建模(FEM)模拟孔隙对位移分布及细胞收缩力所致电势的影响；采用拉伸测试表征扁平纤维垫与三维卷绕支架在干/湿条件下的力学性能；以C2C12成肌细胞进行活/死细胞活力检测、纽蛋白免疫染色与黏着斑(FA)定量、肌球蛋白4免疫荧光与融合指数定量、qPCR检测MyoD与肌生成素(myogenin)表达，并采用纳米振动(nanokicking，NK)生物反应器(1 kHz、30 nm振幅、每日1 h、共5天)进行机械刺激。

研究结果如下。PHBV纤维形貌表征：氯仿/DCM混合溶剂产生光滑无珠纤维，8 wt.%浓度(B8_CD2)纤维平均直径1.27 ± 0.19 μm，针尖-收集器距离增至20与30 cm时纤维直径分别增至1.58 ± 0.44与2.09 ± 0.66 μm并形成多孔结构；MicroCT显示20 cm孔隙率最高(88.93%)，15 cm为85.12%，30 cm降至81.74%；BioTek来源PHBV因溶解性更好、粘度较Sigma-Aldrich产品高约1000倍而更适于电纺。电纺PHBV纤维的FTIR分析：不同距离样品均显示PHBV典型峰(1723 cm^?1酯羰基等)且无位移，表明电纺参数未改变材料化学基团。PHBV纤维的压电性能：Berlincourt法显示d₃₃强烈依赖形貌，15 cm为0.117 ± 0.001 pC/N，20 cm显著提高25倍至2.9 ± 0.2 pC/N，30 cm为0.16 ± 0.06 pC/N；FEM模拟表明纳米纤维位移随孔隙数增加而增大，但过度孔隙会损害力学完整性；VNA识别出串联共振频率1.76041 ± 0.0002 GHz与并联共振频率1.77398 ± 0.0002 GHz，计算得k_t为13.69%；单纳米纤维本征频率模拟为1.68 GHz，主模态为横向振动。力学性能：光滑纤维杨氏模量(约23 MPa)高于多孔纤维(约21 MPa)；卷绕三维圆柱支架在干/湿条件下均承受超过20%应变，优于电纺薄片。支架生物相容性：活/死染色显示各条件均保持高活力，15 cm支架各时间点活力约80%以上，组间无统计学差异。细胞-材料相互作用：LM/PHBV支架上细胞呈伸长形态且黏着斑复合物更强更长，15 cm上细胞长径比与每细胞黏着斑表达高于20 cm。肌肉再生：第5天LM/PHBV与PHBV支架均促成显著肌管形成，15 cm支架约40%肌管形成；第10天15 cm支架促分化能力优于20 cm；15 cm PHBV支架肌管形成显著多于形貌匹配的非压电PCL支架；原子力显微镜(AFM)显示LM在PHBV与PCL纤维上形成相当网络、涂覆后粗糙度均降至约2.5 nm且无显著差异，排除蛋白吸附与表面纳米形貌的混杂影响；FEM估算细胞收缩力在PHBV纳米纤维基质中产生约0.6 mV/10–15 μm细胞接触面积的局部电位(约40–50 mV/mm)，处于C2C12有效电刺激阈值下限。LM/PHBV支架体外促进肌原性分化：第5天qPCR显示MyoD与肌生成素基因较阳性对照上调，早期转录激活先于蛋白水平的肌管形成。机械刺激：NK刺激的LM/PHBV支架肌管形成显著高于未刺激LM/PHBV及NK刺激的LM/PCL对照，表明机电转导而非单纯机械刺激驱动肌原性响应增强。

讨论部分总结：研究人员采用准静态(Berlincourt)与动态(VNA)两种独立技术评估纤维支架纵向压电响应，指出VNA/共振法提取的参数依赖样品有效弹性常数，而Berlincourt法对多孔软支架报告的是反映内禀压电性与支架力学(顺应性、可压缩性)共同作用的有效宏观系数；孔隙引入使d₃₃较非多孔支架提高25倍，随机孔隙分布模拟进一步证实孔隙周围应力重分布增强压电响应；PCL与PHBV支架间及PHBV不同变体间肌原性分化差异反映形貌与机电活性的复杂相互作用，最佳分化出现在低压电性的15 cm支架(d₃₃ ≈ 0.1 pC/N)，表明与天然胶原相当的低水平压电信号配合最优物理结构即可提供仿生机电线索，AFM与FEM结果共同支持PHBV支架优越的肌原性 outcome 源于材料内禀压电性而非表面生化或形貌；PHBV的多功能性、生物相容性及可经电纺调控的特性提示其在骨、软骨与神经修复等广泛组织再生挑战中的适用性；研究局限在于缺乏长期降解研究与长时间循环载荷下的机电疲劳测试，未来需考察支架结构完整性与压电响应在生理相关力学条件下的长期演变。

研究结论翻译：本研究确立了电纺聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)(PHBV)纤维支架作为极具前景的生物材料，即用于再生医学的仿生机电构建体，尤其聚焦于肌肉组织工程。通过系统优化加工参数，研究人员成功制备了孔隙率与纤维形貌受控的支架，显著影响其功能特性。源自准静态(Berlincourt)与动态(VNA)测量的材料表征揭示了对PHBV机电耦合的基于物理的见解。值得注意的是，孔隙的引入使d₃₃较非多孔支架显著提高25倍，利用随机孔隙分布的模拟框架进一步证实了PHBV纳米纤维内孔隙周围应力重分布对压电响应的增强作用。这种增强的压电性与模拟天然肌肉组织的适宜力学性能相结合，提示这些支架在促进有利细胞响应包括分化方面具有高度潜力。PCL与PHBV支架之间以及PHBV变体之间的肌原性分化差异反映了支架形貌与机电活性之间的复杂相互作用，最佳分化见于低压电性的15 cm支架(d₃₃ ≈ 0.1 pC/N)，表明即使与天然胶原相当的低水平压电信号，在与最有利的物理结构相配合时也足以提供仿生机电线索；AFM表征证实层粘连蛋白吸附在PHBV与PCL支架上产生等效表面涂层(约2.5 nm RMS，无显著差异)，排除了蛋白吸附密度或表面纳米形貌作为混杂变量；有限元建模表明细胞产生的收缩力足以在静态条件下于PHBV纳米纤维基质内产生约0.6 mV/10–15 μm细胞接触面积的局部电位(约40–50 mV/mm)，与文献报道的C2C12细胞有效电刺激下限一致。这些发现共同确立PHBV支架优越的肌原性结果源于材料内禀压电性而非表面生化或形貌。尽管当前聚焦于肌肉组织工程，PHBV的多功能性、生物相容性及通过电纺定制其性能的能力提示其在应对骨、软骨与神经修复等多种组织再生挑战中的广泛适用性。利用NK在动态条件下进一步验证了压电性的功能相关性，NK刺激的LM/PHBV支架肌管形成显著高于未刺激LM/PHBV支架及NK刺激的PCL对照，证实机电转导而非单纯机械刺激驱动了增强的肌原性响应。结果与PHBV压电活性对肌原性分化增强的功能性贡献一致，该效应在动态培养条件下放大，并与基因表达和蛋白水平分析中观察到的后期渐进性肌原性定型一致。本研究为压电PHBV支架在更广泛组织工程应用中的未来研究奠定了基础。然而，本研究的局限在于缺乏长期降解研究与长时间循环载荷下的机电疲劳测试，未来工作应考察支架结构完整性与压电响应在生理相关力学条件下长期内的演变。