《Veterinary Research》：Tembusu virus induces lipid droplet accumulation to facilitate viral replication in neuronal cells via AMPK-mediated ATGL suppression
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Tembusu virus（TMUV）是一种嗜神经性禽源黄病毒，可引起鸭病毒性脑炎和产蛋下降综合征，在亚洲养鸭地区造成重大经济损失。脂滴（LD）是源自内质网的细胞器，主要储存中性脂质，并参与病毒复制与致病过程。然而，LD在TMUV复制及神经致病中的作用尚不清楚
Tembusu virus（TMUV）是一种嗜神经性禽源黄病毒，可引起鸭病毒性脑炎和产蛋下降综合征，在亚洲养鸭地区造成重大经济损失。脂滴（LD）是源自内质网的细胞器，主要储存中性脂质，并参与病毒复制与致病过程。然而，LD在TMUV复制及神经致病中的作用尚不清楚。本研究报告，TMUV感染可升高小鼠神经母细胞瘤细胞（Neuro-2a）中的三酰甘油（TG）水平并促进LD蓄积。以特定药物抑制TG合成与LD蓄积可降低TMUV复制，而补充油酸（OA）则增加LD蓄积并增强病毒复制，表明LD促进TMUV复制。此外，在TMUV感染的ICR小鼠或雏鹅中，研究人员评估了脑组织内LD蓄积及其对病毒复制和病理变化的影响。TMUV感染升高脑内TG水平并促进LD蓄积。抑制LD蓄积可降低病毒复制并减轻病变，而增强LD蓄积则产生相反效应，表明LD促进TMUV神经致病性。研究人员进一步探究了TMUV诱导LD蓄积的机制，发现TMUV下调脂解酶脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）。过表达ATGL可减少TG生成与LD蓄积，从而抑制TMUV复制，而敲低ATGL则产生相反效应。此外，TMUV激活AMP活化蛋白激酶（AMPK）信号通路以抑制ATGL表达，导致TG水平升高与LD蓄积，进而增强病毒复制。综上，这些发现表明，TMUV感染经AMPK介导的ATGL抑制诱导LD蓄积，从而促进病毒复制，且LD蓄积参与TMUV神经致病过程。
研究背景与问题：Tembusu virus（TMUV）于1955年首次从马来西亚库蚊中分离，属黄病毒科正黄病毒属节肢动物传播RNA病毒，基因组约11 kb，编码3种结构蛋白（衣壳蛋白、前膜蛋白、囊膜蛋白）和7种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）。2010年中国主要养鸭区暴发鸭TMUV疫情，此后泰国、马来西亚等地亦有报道。TMUV可致鸭全身性感染，引起产蛋鸭产蛋量严重下降、雏鸭生长迟缓与神经疾病甚至死亡。其宿主范围还涉及鸡、鹅、家麻雀，并有海豚自然感染致死及小鼠实验感染的报道，鸭场工人血清和口腔拭子中亦检出TMUV阳性，提示其潜在人兽共患风险。与日本脑炎病毒（JEV）、登革病毒（DENV）、寨卡病毒（ZIKV）、西尼罗病毒（WNV）等嗜神经黄病毒类似，TMUV可侵入中枢神经系统引起病毒性脑炎，阐明其神经致病机制对疫苗研发和防控策略至关重要。脂质在嗜神经病毒生命周期中发挥关键作用，并与感染所致神经损伤相关；LD主要由TG和胆固醇酯构成，是细胞内中性脂质储存的主要场所，二酰甘油酰基转移酶1（DGAT1）和DGAT2催化TG合成，PLIN家族蛋白调控LD稳定性，LD经ATGL或脂噬降解。已有研究表明多种病毒通过调控脂质代谢利于自身复制，黄病毒科成员ZIKV可致人神经细胞LD显著蓄积并促进其复制与致病，但脂质代谢与LD在TMUV复制和感染中的作用尚不明确。本研究旨在探究LD在TMUV复制和感染中的作用，并部分阐明TMUV利用脂质代谢促进复制的机制。
研究开展与结论：研究人员检测了TMUV感染Neuro-2a细胞及小鼠脑组织中的TG生成与LD蓄积，评估其对TMUV复制和神经致病性的影响，进而研究ATGL在TMUV诱导TG生成和LD蓄积中的作用并鉴定其上游调控信号分子，阐明TMUV调控ATGL促进LD蓄积从而利于病毒复制的途径。结论为：TMUV感染经AMPK介导的ATGL抑制诱导LD蓄积以促进病毒复制，LD蓄积参与TMUV神经致病过程，提示靶向LD形成可能成为抗TMUV感染的潜在治疗策略。
主要技术方法：研究以BHK-21细胞增殖TMUV AQ-19株（GenBank登录号MT708901.1），以小鼠神经母细胞瘤细胞（Neuro-2a）为体外模型，感染复数（MOI）为0.5；采用BODIPY 493/503染色结合激光扫描共聚焦显微镜及ImageJ定量分析LD蓄积，油红O染色观察细胞与脑组织LD，TG检测试剂盒测定胞内TG；采用CCK-8法评估细胞活力；通过qRT?PCR检测NS5基因拷贝数及脂滴代谢相关基因表达，western blotting检测PLIN2、ATGL、AMPK、磷酸化AMPK（p-AMPK）及病毒NS1蛋白；通过HA-ATGL质粒过表达与siRNA敲低调控ATGL，并用DGAT1抑制剂A922500、DGAT2抑制剂PF-06424439、油酸（OA）、AMPK抑制剂Compound C及ATGL抑制剂Atglistatin进行药理学干预；动物实验采用3周龄雌性ICR小鼠（每组n = 9，颅內接种30 μL病毒原液）及1日龄雏鹅（每组n = 6，肌肉接种0.5 mL病毒原液），雏鹅来源于安徽省健康鹅群，小鼠购自安徽医科大学实验动物中心，脑组织用于western blotting、qRT?PCR、油红O染色、免疫组化（IHC）及苏木精-伊红（H&E）染色。
研究结果：
TMUV感染促进Neuro-2a细胞TG合成并诱导LD蓄积：感染后12、24、36 hpi胞内TG显著升高，共聚焦显微镜显示LD数量随时间递增，36 hpi油红O染色进一步证实LD蓄积明显增加。
TG合成与LD蓄积促进TMUV复制：DGAT1抑制剂A922500（20 μM）或DGAT2抑制剂PF-06424439（140 μM）预处理显著降低感染细胞TG水平并减轻LD蓄积，同时病毒拷贝数与NS1蛋白表达下降；OA（100 μM）预处理则增加TG合成与LD蓄积并伴随病毒复制增强。
TMUV感染诱导小鼠脑内TG生成与LD蓄积并增强病毒神经致病性：脑组织TG水平在2、4、6 dpi逐渐升高，6 dpi油红O染色显示明显LD蓄积，PLIN2 mRNA与蛋白水平显著上调并于6 dpi达峰，与脑内病毒复制增强一致；OA+AQ-19组病毒拷贝数、NS1表达及IHC阳性信号最强、病变最重，A922500+AQ-19组则显著降低并减轻病变，H&E染色显示OA+AQ-19组炎性细胞浸润和血管套现象最严重而A922500+AQ-19组病变明显减轻；在雏鹅脑中亦证实AQ-19感染升高TG、诱导LD蓄积并上调PLIN2，OA增强而A922500抑制病毒复制并相应加重或减轻脑病变。
TMUV感染下调Neuro-2a细胞ATGL表达：感染显著上调PLIN2 mRNA与蛋白水平而下调ATGL表达；Plin3转录水平在36 hpi上调，Srebp1在12和36 hpi显著上调，Srebp2无显著变化，另一脂解酶Hsl仅在12 hpi下调，提示LD蓄积主要与PLIN2表达升高及ATGL介导的TG水解受抑相关，胆固醇合成途径作用有限。
过表达ATGL减少LD蓄积并抑制TMUV复制：HA-ATGL转染细胞TG水平显著低于空载体对照，LD蓄积明显减少，24和36 hpi病毒拷贝数及36 hpi NS1蛋白水平均显著降低。
敲低ATGL增加LD蓄积并促进TMUV复制：siRNA-2有效沉默ATGL表达，其转染细胞TG水平与LD蓄积显著高于siRNA-NC组，24和36 hpi病毒拷贝数及NS1蛋白表达显著升高；ATGL抑制剂Atglistatin（20 μM）处理亦增加TG与LD蓄积并增强病毒复制。
AMPK–ATGL信号在TMUV诱导LD蓄积中发挥重要作用：感染后AMPK mRNA在12和24 hpi显著升高而36 hpi无显著差异，总AMPK与p-AMPK蛋白水平在12、24、36 hpi均显著升高；Compound C（5 μM）预处理使ATGL mRNA在24和36 hpi显著回升、ATGL蛋白上调而NS1蛋白下降，病毒拷贝数在12、24、36 hpi显著降低，胞内TG水平与LD蓄积显著减少，表明TMUV以AMPK依赖方式下调ATGL并诱导LD蓄积。
讨论与结论：LD是储存脂质尤其TG的动态细胞器，维持细胞脂质与能量稳态并具多种生物学功能；病毒缺乏自主代谢能力，须依赖宿主细胞完成生命周期，多种病毒可利用LD及LD相关组分促进复制与致病，如狂犬病病毒感染增强LD形成以利于病毒出芽，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染升高胞内TG促进LD蓄积与复制。本研究显示TMUV感染显著升高Neuro-2a细胞TG并诱导LD蓄积，与ZIKV、丙型肝炎病毒（HCV）等黄病毒操纵宿主脂质代谢的报道一致；抑制DGAT减少LD蓄积可降低TMUV复制，OA诱导TG与LD增加则促进复制。在ICR小鼠和雏鹅中，TMUV感染诱导脑内TG升高与LD蓄积，A922500+AQ-19组脑内病毒载量最低、病变最轻，与ZIKV感染中A922500减少LD蓄积与复制并使小鼠存活率提高75%、甲型流感病毒（IAV）感染中抑制SREBP2减少LD蓄积并改善存活的报道相呼应，提示靶向LD形成可能是抗TMUV感染的有前景策略。机制上，TMUV下调脂解限速酶ATGL，过表达ATGL降低TG与LD并抑制复制，敲低则相反；HCV核心蛋白可通过结合ATGL抑制脂解诱导脂肪变性，PRRSV Nsp4可诱导ATGL降解，本研究结果共同表明TMUV下调ATGL抑制TG水解从而促进LD蓄积与病毒复制。AMPK作为能量感受器是ATGL上游调控因子，研究人员前期已证实TMUV感染激活AMPK诱导不完全自噬并促进Neuro-2a细胞病毒复制，本研究中Compound C恢复TMUV诱导的ATGL下调、抑制TG合成与LD蓄积并抑制病毒复制，表明TMUV经AMPK–ATGL轴诱导LD蓄积促进自身复制；与牛病毒性腹泻病毒（BVDV）经AMPK–PNPLA2/ATGL信号诱导脂噬动员能量支持复制的报道一致，但具体由何种TMUV蛋白调控该轴尚待进一步研究。研究结论为：TMUV诱导TG水平升高与LD蓄积，从而增强病毒复制与神经致病性；TG含量增加与LD蓄积由AMPK调控的ATGL表达介导；本研究有助于阐明脂质代谢在TMUV感染中的作用，并为抗TMUV药物开发提供新的潜在靶点。
