《Veterinary Research》：A single-spheroid bovine mammary co-culture model for longitudinal monitoring and preclinical safety assessment of antimicrobial alternatives against mastitis-causing pathogens
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牛乳腺炎仍是奶牛生产中抗菌药物使用的主要驱动因素，凸显了建立生理相关体外模型以对新型乳房内治疗药物进行临床前安全性评估的必要性。本研究将先前建立的牛上皮细胞系共培养乳腺球模型适配至96孔超低吸附（ULA）单球体格式，提高了可重复性和纵向监测能力。乳腺球维持了上
牛乳腺炎仍是奶牛生产中抗菌药物使用的主要驱动因素，凸显了建立生理相关体外模型以对新型乳房内治疗药物进行临床前安全性评估的必要性。本研究将先前建立的牛上皮细胞系共培养乳腺球模型适配至96孔超低吸附（ULA）单球体格式，提高了可重复性和纵向监测能力。乳腺球维持了上皮组织架构，并通过酪蛋白（casein）表达评估进一步表征了其分泌功能。随后，在Triton X-100诱导细胞毒性后，采用互补的荧光显微镜、动态活细胞成像和流式细胞术评估了该模型用于安全性评估的适用性。利用该工作流程，评估了噬菌体来源重组裂解酶LysMK34和抗生素卡那霉素（kanamycin）单独及联合应用的安全性，未观察到细胞毒性效应，支持该模型用于未来临床前乳房内安全性评估的实用性。
牛乳腺炎是奶牛养殖业中经济意义重大的传染性疾病，全球亚临床和临床乳腺炎发病率分别为42%和15%。该病不仅发病率高，还因产奶量下降、淘汰率增加、治疗成本和动物福利受损造成重大经济损失。在引起临床乳腺炎的病原体中，大肠杆菌（Escherichia coli）是最常分离的革兰氏阴性致病菌，通常与急性和严重临床症状相关。其治疗和预防管理仍依赖传统全身或乳房内抗生素给药，使乳腺炎成为畜牧生产中抗生素使用的主要驱动因素之一。此外，自2022年1月起，欧盟兽药法规2019/6禁止在动物群体中常规预防性使用抗生素，凸显了开发有效替代抗菌策略的紧迫需求，且优选局部给药方式。在此背景下，噬菌体来源抗菌药物作为传统抗生素治疗的潜在替代或辅助手段日益受到关注，旨在减少兽医临床中抗生素的使用。
裂解酶（lysins）是噬菌体编码的肽聚糖水解酶，在噬菌体复制周期末期裂解被感染的细菌细胞，通过靶向细菌细胞壁肽聚糖层中的特定键发挥作用。重组裂解酶可作为酶基抗生素（"enzybiotics"）使用，基于外源添加后快速的肽聚糖降解和渗透性裂解。这些天然蛋白对革兰氏阳性病原体表现出强杀菌活性，但其对革兰氏阴性菌的应用历来受限于外膜的存在限制了接触肽聚糖层。然而，少数裂解酶（包括来源于鲍曼不动杆菌噬菌体PMK34的LysMK34）已被证明具有对革兰氏阴性菌的内在活性，通常不需要外膜渗透剂或事先基因工程改造即可促进外膜穿透。尽管裂解酶通常被认为对细菌肽聚糖具有高度特异性，但对牛乳腺上皮细胞的的安全性评估仍至关重要，特别是针对革兰氏阴性菌的裂解酶可能含有参与外膜穿透的膜活性或两亲性区域。在此类新型抗菌药物推进至临床应用之前，必须使用牛乳腺上皮细胞（bMECs）在体外评估其对靶宿主组织（即牛乳房）的安全性。
此类临床前安全性评估需要能够重现分泌性牛乳腺腺泡的细胞结构和功能特性的生理相关体外模型。由于乳腺炎主要发生在泌乳早期，生理相关的安全性模型不仅应重现乳腺腺泡的上皮组织架构，还应重现其分泌活动，包括产生乳蛋白如酪蛋白的能力。酪蛋白约占牛乳总蛋白的80%，是乳腺上皮细胞泌乳分化的重要标志物。传统二维（2D）细胞培养模型缺乏这种结构复杂性以及体内存在的细胞间相互作用，限制了其转化价值。相比之下，三维（3D）乳腺球系统允许bMECs自组织成多细胞聚集体，更接近腺泡结构并支持上皮极化。研究团队近期建立了一种新型无基质超低吸附（ULA）牛乳腺球模型，由共培养的腔面BME-UV1细胞和基底MAC-T细胞组成，提供了可重复且无动物源的平台，支持生理性上皮组织架构（包括紧密连接形成）。与替代的细胞外基质包埋条件相比，ULA的主要优势在于提供无基质环境，确保球体与以确定浓度添加的任何化合物直接接触，这对安全性筛选应用尤为有利。然而，该ULA乳腺球系统建立在24孔板中，每孔产生大量大小不一的球体，限制了可重复性和单个球体的纵向监测。这两个标准对于其作为临床前安全性评估工具至关重要，因此在当前后续研究中进一步探索。
本研究首先旨在通过在96孔ULA板中建立单球体设置来提高模型的可重复性，并通过闭锁小带蛋白-1（ZO-1）和肌动蛋白（actin）染色分别重新评估上皮屏障形成和细胞极化。随后，通过评估酪蛋白产生来评价其分泌能力。接着，在Triton X-100诱导细胞毒性后，采用互补的活力评估方法（包括荧光显微镜、动态活细胞成像和流式细胞术）研究该模型作为体外安全性筛选工具的适用性。最后，应用这些方法评估传统氨基糖苷类抗生素卡那霉素（作为针对革兰氏阴性乳腺炎的代表性常规乳房内抗生素）和噬菌体来源裂解酶LysMK34（因其先前报道的对革兰氏阴性菌的内在活性而被选为概念验证性酶基抗菌药物）的安全性。在优化的共培养单乳腺球模型中评估了两种治疗单独及联合应用的安全性。
共培养BME-UV1和MAC-T乳腺球按照Bellemans等的方法在ULA条件下重现。为每孔生成单个乳腺球，将两种密度的BME-UV1细胞（每孔2500或4000个细胞，200 μL BME-UV1增殖培养基，0.32 cm2表面积）接种于U形底96孔ULA板中。接种后，板以250 g离心10分钟使细胞聚集于孔底。BME-UV1细胞作为乳腺球培养7天，包括5天在BME-UV1增殖培养基中随后2天在BME-UV1分化培养基中。第7天加入2500个MAC-T细胞，板再次以250 g离心10分钟以确保细胞与乳腺球接触，并在BME-UV1和MAC-T分化培养基1:1（v/v）混合物的分化培养基中维持4天。共培养乳腺球总共生长长达11天。通过相衬成像动态测定单个乳腺球生长动态（乳腺球直径和面积），使用BioTek Cytation? 5细胞成像多功能阅读器集成BioTek BioSpa活细胞分析系统实现自动化孵育和机器人板转移以进行纵向图像采集。在乳腺球形成过程中，从接种后16小时开始每8小时采集图像，直至第3天和第4天，然后从第7天至第11天再次采集。使用Gen5软件版本3.12从采集的图像中定量乳腺球直径和表面积。第7天加入MAC-T细胞后，软件无法区分BME-UV1乳腺球和单个MAC-T细胞，因此从第7天开始的三个时间点被排除在分析之外。结果以平均值±标准差（SD）表示。
免疫荧光分析中，乳腺球在4%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）中固定，按照Bellemans等描述的程序进行免疫染色。使用针对腔面角蛋白（K）8、基底K14、紧密连接蛋白ZO-1和细胞骨架肌动蛋白的一抗。所有步骤均在双目立体显微镜下进行以尽量减少乳腺球丢失。荧光图像使用共聚焦激光扫描显微镜采集，使用Zen软件操作。为评估乳酪蛋白表达，从乳腺球中提取蛋白质，定量并通过western blotting分析。简言之，使用60 μL放射免疫沉淀试验（RIPA）提取试剂从沉淀的共培养乳腺球或单独培养的BME-UV1或MAC-T细胞2D单培养物中提取蛋白质。涡旋、冰上孵育5分钟、4°C下13000 g离心10分钟后，收集可溶性蛋白组分并使用二喹啉甲酸（BCA）测定试剂盒定量。每个样品15 μg蛋白通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）在NuPage 4-12% Bis-Tris凝胶中分离，并电转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。膜在4°C下与 primary anti-bovine casein（1:1000稀释）或抗β-肌动蛋白（1:5000稀释）抗体孵育过夜。然后与适当的二抗（抗兔IgG或抗小鼠IgG，1:5000稀释）在室温下孵育2小时。使用增强化学发光（ECL）底物检测免疫反应蛋白，使用ImageQuant? LAS4000成像系统捕获化学发光信号。β-肌动蛋白用作上样对照。
活力测试中，首先通过将11天龄乳腺球与0.001% Triton X-100在PBS中稀释孵育24小时生成阳性对照。仅与PBS孵育24小时的乳腺球作为阴性对照。比较两种对照以评估活力评估方法在单共培养乳腺球模型中检测细胞毒性效应的能力。随后，这些方法应用于评估LysMK34（2 μM）和卡那霉素（20 μg/mL）在24小时暴露后的安全性，浓度与抗菌活性相关，单独或联合处理。使用三种互补方法评估活力，每种方法在单独一组相同处理的单乳腺球上进行。第一种方法基于在暴露于相应对照或抗菌治疗条件后立即将碘化丙啶（PI；终浓度0.5 μg/mL）和Hoechst 33342（终浓度2.5 μg/mL）直接加入培养基中。在24小时孵育期间每2小时使用Cytation? 5细胞成像系统对乳腺球PI荧光进行成像，实现跨治疗条件的细胞死亡比较纵向评估。PI信号强度使用Gen5?软件定量为每个球体的积分荧光强度并归一化至初始时间点（t=0）以考虑乳腺球之间的基线差异。第二种方法包括在24小时治疗孵育后将两种荧光染料以各自浓度直接加入相同处理的乳腺球培养基中，随后进行终点荧光成像。第三种方法包括在24小时孵育后使用Viobility? 488/520可固定染料试剂盒按照供应商说明对乳腺球进行活/死活力测定。染色后，乳腺球轻柔洗涤并在4% PFA中固定，用2%牛血清白蛋白（BSA）封闭，并用Hoechst 33342（终浓度5 μg/mL）复染。终点荧光成像使用THUNDER落射荧光显微镜进行。此外，乳腺球解离成单细胞悬液后通过流式细胞术定量评估活力。首先在24孔板中培养比较阳性和阴性对照的活力。然后在96孔ULA板格式中再次将抗菌化合物与阴性对照比较。解离前，小心去除分化培养基，乳腺球用PBS洗涤。对于24孔板，板倾斜45°使乳腺球通过重力沉降，然后小心去除培养基或PBS。对于96孔板设置，板以200 g离心5分钟使乳腺球位于U形孔底部，允许去除培养基或PBS。然后通过用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）在37°C和5% CO2下胰蛋白酶消化15分钟将乳腺球解离成单细胞，每5分钟手动吹打重悬。对于24孔板的单细胞悬液，细胞转移至1.5 mL微量离心管并以300 g离心10分钟。细胞沉淀随后重悬于100 μL PBS中并转移至新的96孔V形底板。来自ULA 96孔板的单细胞保留在同一板中，以450 g离心5分钟，通过板翻转去除上清液。在孵育缓冲液[10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），140 mM NaCl，5 mM CaCl2·2H2O，pH 7.4]中制备Annexin V-FITC（1:500稀释）和PI（终浓度1 μg/mL）双染色溶液。单细胞用100 μL该双染色溶液染色并在室温暗处孵育10分钟，随后重悬于80 μL孵育缓冲液中。为实现准确的体积定量，将BD TruCount?微珠重悬于含1% BSA的PBS中，每样品加入20 μL所得微珠悬液。使用CytoFLEX三激光流式细胞仪进行流式细胞术分析。绝对细胞数基于TruCount?微珠技术计算，考虑稀释因子。细胞群体使用象限门控策略分类：活细胞对应Annexin V?/PI?群体，早期凋亡细胞对应Annexin V+/PI?群体，晚期凋亡/坏死细胞对应Annexin V+/PI+群体。
统计分析使用GraphPad Prism软件进行。适用时使用Shapiro-Wilk检验评估数据正态性，重复测量分析残差分布通过正态分位数-分位数（Q-Q）图视觉评估。比较阴性和阳性对照组的终点流式细胞术数据使用非配对双尾Student's t检验分析。抗菌治疗组和阴性对照之间的终点流式细胞术数据使用单因素方差分析（ANOVA）随后Bonferroni多重比较检验分析。纵向数据（包括模型优化期间的乳腺球直径和面积、动态PI荧光强度以及治疗后乳腺球直径和面积变化）使用双因素重复测量ANOVA with Geisser-Greenhouse校正随后Bonferroni多重比较检验分析。P<0.05认为差异具有统计学意义。
研究结果方面，首先，确定了在ULA 96孔板格式中生成可重复单球体所需的最佳BME-UV1细胞接种密度。初步实验中比较了2500个细胞（n=9）和4000个细胞（n=11）的接种密度。在增殖培养基中培养5天后，两种条件均形成单个增殖性球体。然而，4000个细胞生成的球体平均直径（368.65±62.60 μm）显著大于2500个细胞生成的球体（290.74±24.00 μm；p=0.027），且变异性增加。与此一致，较高接种密度条件的平均球体面积（10.74×10?±3.82×10? μm2）显著高于较低接种密度条件（6.55×10?±1.00×10? μm2；p=0.0082），前者变异性也更大。基于这些初步发现，所有后续ULA 96孔板实验均使用2500个BME-UV1细胞的接种密度。培养11天后，获得了可重复的乳腺球（n=24），显示一致的球体形态，平均直径1031.27 μm（±51.31 μm），平均表面积81.90×10? μm2（±7.73×10? μm2）。重要的是，乳腺球始终定位于U形底孔中心，使得使用活细胞成像进行可靠的自动化纵向监测成为可能。部分乳腺球（4/24；16.7%）观察到偏离典型球体形态的情况，这些形态偏差源于多个较小球体随时间的渐进融合。免疫荧光染色进一步证实了腔面和基底bMEC的成功共培养，在同一乳腺球结构中检测到K8阳性BME-UV1细胞（红色）和K14阳性MAC-T细胞（绿色）。总体而言，96孔ULA板设置能够以可接受的可重复性生成每孔单个共培养乳腺球。
使用活细胞成像系统对单乳腺球进行动态监测显示，其直径和面积在11天内渐进增加。乳腺球直径从接种后16小时的336.40 μm（±69.97 μm）近线性增加至第11天（261小时）的1031.27 μm（±51.31 μm），相应平均表面积从8.64×10? μm2（±3.01×10? μm2）增加至81.90×10? μm2（±7.73×10? μm2）。值得注意的是，直径的变异性随时间保持相对稳定，而面积的变异性增加，特别是在加入MAC-T细胞后。
为评估单共培养乳腺球内的上皮组织架构，通过共聚焦显微镜Z-stack成像评估了紧密连接表达和细胞骨架组织。观察到与Bellemans等一致的ZO-1染色模式，特征为细胞-细胞边界处 sharp and continuous定位，表明组织化的上皮连接。同样，肌动蛋白染色揭示了支持3D乳腺球架构的结构化细胞骨架网络。这些观察证实，在24孔（每孔多个球体）和96孔（每孔单个球体）培养格式中均可重复实现可比的上皮组织架构。为进一步表征牛乳腺球模型的功能特性，通过评估乳酪蛋白产生来评估其分泌能力。共聚焦Z-stack成像显示酪蛋白存在于整个乳腺球中。互补的western blot分析证实乳腺球中稳健的酪蛋白表达，而单独培养的2D BME-UV1和MAC-T细胞显示较低的酪蛋白表达，且仅显示单个酪蛋白条带，而乳腺球中观察到两个条带。
为评估乳腺球模型作为候选抗菌化合物安全性评估筛选工具的适用性，验证了三种互补的活力评估方法。在0.001% Triton X-100作为阳性对照处理24小时后测定细胞活力，与假处理（即PBS）阴性对照比较。终点活力评估使用两种荧光成像方法（PI/Hoechst染色和Viobility?染料/Hoechst染色）以及定量Annexin V/PI流式细胞术。同时，使用PI/Hoechst染色的动态荧光成像应用于24小时治疗期间细胞死亡的纵向监测。荧光终点成像显示乳腺球核心内存在PI阳性细胞或Viobility?染料标记的死细胞，表明乳腺球中心活力降低。相比之下，阴性对照中外层细胞大部分保持活力，而Triton X-100处理后观察到大量外周细胞死亡。单解离细胞的流式细胞术分析显示，Triton X-100处理后活细胞数（5369±814个细胞）较PBS对照（38245±22905个细胞）明显减少。然而，由于阴性对照组内 substantial variability，该差异未达到统计学显著性（p=0.1）。使用PI/Hoechst染色的24小时动态荧光成像显示，两种条件下PI积累随时间渐进增加，Triton X-100处理后始终高于阴性对照。虽然在早期孵育期间差异已显现，但统计学显著性在治疗22小时后首次达到，PI强度从阴性对照的8.50×10?±8.35×10?增加至Triton X-100暴露后的1.15×101?±2.56×10?（p=0.013）。该差异随时间进一步增加，24小时后分别达到8.82×10?±8.46×10?和1.21×101?±2.06×10?（p=0.0038）。同一孵育期间乳腺球直径和面积变化的纵向监测显示，阳性和阴性对照条件在任何时间点均无显著差异。
为评估LysMK34（选为新型enzybiotics类的模型抗菌化合物）和卡那霉素的安全性，单乳腺球用LysMK34单独、卡那霉素单独或其联合处理24小时，并使用互补活力评估工作流程分析。终点荧光成像显示，与阴性对照相比，LysMK34单独、卡那霉素单独或联合处理均未增加乳腺球外周细胞死亡。在所有条件下均观察到乳腺球中心PI和Viobility?阳性死细胞的积累，强度相当，表明球体核心活力降低，与阳性和阴性对照实验中所观察到的相同。流式细胞术分析显示，与阴性对照相比，LysMK34、卡那霉素或联合处理乳腺球的绝对活细胞数无显著差异，治疗组之间也无差异，平均活细胞数分别为13137±1207、11141±4262、14086±3892和12399±3983个细胞。同样，24小时动态PI荧光成像显示，与阴性对照相比，LysMK34单独、卡那霉素单独或其联合暴露后细胞死亡无显著增加，治疗组之间也无差异。
讨论部分，本后续研究旨在将Bellemans等先前建立的牛共培养乳腺球模型适配为更适合纵向监测和新型乳房内治疗药物临床前安全性评估的可重复单球体筛选工具。为此，将原始无基质ULA 24孔共培养系统适配为适合纵向监测的单乳腺球96孔格式。同时评估了原始模型中观察到的关键结构特征（包括上皮组织架构和细胞骨架组织）在该适配配置中是否得以保持。此外，通过评估乳酪蛋白产生进一步功能表征了该模型，并使用Triton X-100作为阳性对照评估了互补活力评估方法的适用性。最后，使用噬菌体来源裂解酶LysMK34和广谱抗生素卡那霉素（单独及联合治疗）研究了该模型用于安全性筛选的适用性。
为建立可重复的共培养乳腺球模型，研究团队重点关注优化单球体形成和细胞活力监测。先前描述的ULA共培养系统成功证明腔面BME-UV1和基底MAC-T细胞可以共存并自组织成显示生理性上皮特征的多细胞乳腺球。该平底24孔ULA设置能够每孔生成多个乳腺球并提供无基质环境，允许治疗化合物与乳腺球之间直接相互作用。然而，也遇到了一些局限性。由于ULA条件，乳腺球保持自由悬浮，使单个球体的纵向监测复杂化。此外，球体大小的显著变异性降低了整体实验均匀性。而且，相应的乳腺球直径变异性也较高，约为35%。最后，在24孔格式中，共培养形成并非始终实现，仍观察到单培养的BME-UV1球体。相比之下，在优化的96孔单乳腺球格式中，直径变异性降低至约5%，乳腺球面积变异性约为9.4%，且共培养形成始终实现。
可重复球体形成的关键参数是初始细胞接种密度。虽然尚未发表bMECs的可比研究，但使用癌症来源3D球体模型的几项研究已在96孔格式中探索了广泛的接种密度范围。例如，Pereira等评估了每孔2500至高达20000个细胞的密度，报告较低接种密度（2500-5000个细胞）更适合持续增殖的细胞系和较长培养持续时间。同样，Vitacolonna等在不同人类细胞系中使用了每孔500至5000个细胞的接种密度，而Selby等报告最佳接种密度为每孔1250-5000个细胞（取决于NCI60细胞系），产生平均直径约500 μm的球体。考虑到BME-UV1约14小时的快速倍增时间和共培养 envisage的延长培养持续时间（>10天），进行了比较2500和4000个BME-UV1细胞的初步实验。在增殖条件下5天后，4000个BME-UV1细胞生成的球体显示出比2500个细胞生成的球体更大的平均直径和面积。此外，与较低接种密度相比，这两个参数的变异性也增加。重要的是，较大的球体在延长培养期间容易因缺氧和球体结构内营养物质及其他分子运输的扩散相关限制而发展坏死核心。因此，选择2500个细胞作为后续表征和安全性评估实验的接种密度。培养11天后，该优化设置产生了在直径和面积方面均可重复的共培养乳腺球。尽管如此，一些球体显示出轻微形态偏差，包括不规则或多叶球体结构。这些偏差可能源于球体成熟过程中较小细胞聚集体的融合，这是无支架球体培养中描述的现象，可能反映了悬浮环境中持续的动态细胞-细胞重组。研究团队建议在设计实验时应考虑到这一点，更具体地说在确定筛选应用所需的重复数时。然而，这种变异性水平仍足够有限，支持进一步评估该模型用于筛选目的。单牛乳腺球直径和面积均随时间增加，直径在增殖期和共培养分化第11天之间线性增加约三倍。值得注意的是，面积扩展遵循双相曲线，在第7天加入MAC-T细胞并切换至分化培养基后变得更加明显。因此，除持续细胞增殖外，这种非线性扩展也可能反映分化相关的细胞增大和分泌活动增加。分化的bMECs经历 substantial organelle remodeling，包括为乳蛋白合成和分泌所需的内质网和高尔基体扩张。此外，面积观察到的更明显变异性至少部分可能反映MAC-T细胞围绕单个BME-UV1乳腺球附着或分布程度的差异。
在初始BME-UV1细胞接种和随后MAC-T细胞添加期间引入离心步骤导致细胞聚集和U形底孔底部细胞-球体直接接触。这促进了单个和紧凑乳腺球形成，与原始共培养相比提高了效率和可重复性。这大大改善了球体均匀性，进而使得使用动态成像对单个乳腺球进行可靠的纵向追踪成为可能。然而，必须确认原始多球体模型的关键结构特征在单球体中得以保持。在96孔ULA板中生成的共培养乳腺球表达ZO-1和肌动蛋白，表明形成了原始上皮屏障和细胞骨架组织。这表明向单球体格式的转变不损害上皮细胞间完整性。
为进一步表征模型的功能能力，通过酪蛋白表达评估其泌乳分化。免疫荧光显微镜显示细胞内酪蛋白定位，与分泌性乳腺上皮细胞体内观察到的主要乳蛋白 active synthesis和intracellular accumulation一致。使用pan-casein抗体的互补western blot分析显示，3D共培养乳腺球裂解物中两个 distinct casein bands，而BME-UV1和MAC-T细胞2D单培养物裂解物中仅检测到单个（且强度较低）条带。由于所有培养物均暴露于相同的分化培养基，3D共培养条件下检测到额外酪蛋白组分表明更复杂的架构和腔面-基底细胞相互作用可能有助于更广泛的乳酪蛋白表达激活。这些发现进一步支持研究团队先前的建议，即分化期间乳腺球直径和面积的渐进增加可能不仅反映增殖，还反映泌乳活动。总之，这些观察支持模型的生理相关性及其与体内泌乳乳腺腺泡的更接近 resemblance。
基于这些发现，研究团队进一步研究了该模型作为候选乳房内治疗药物初始安全性评估体外平台的适用性，重点关注治疗相关的对乳腺球活力的影响。在评估LysMK34和卡那霉素（单独及联合）的安全性特征之前，确定了 detergent Triton X-100作为阳性对照是否诱导细胞毒性效应。该效应使用互补活力评估方法监测，包括：(i) 基于PI/Hoechst和Viobility?/Hoechst染色的终点荧光显微镜评估乳腺球活力和治疗相关细胞死亡；(ii) 定量Annexin V/PI流式细胞术分析测定活细胞数；(iii) 使用PI/Hoechst染色的动态活细胞荧光成像监测乳腺球随时间内的细胞死亡。
Triton X-100暴露后，荧光成像清晰显示广泛的外周细胞死亡，而假处理（阴性对照）乳腺球大部分保持活力的外层细胞。应指出，两种条件下均观察到乳腺球核心的细胞死亡，这可能反映扩散受限区域导致氧气和营养可用性降低，如研究团队先前所述。解离乳腺球的流式细胞术分析显示阳性对照较阴性对照活细胞数明显减少，但未观察到统计学显著差异。后者最可能是由阴性对照组内 substantial variability引起的。动态活细胞成像显示假处理和Triton X-100处理乳腺球中PI强度随时间渐进增加，可能至少部分反映上述扩散受限乳腺球核心内PI阳性细胞的持续积累。然而，Triton X-100处理诱导了显著更强的PI强度增加，24小时后达到约1.4倍于假处理乳腺球的水平。这些发现证实了方法学检测治疗相关细胞毒性效应的能力。相比之下，乳腺球直径和面积的纵向监测未显示Triton X-100处理和假处理乳腺球之间的显著差异。
使用该互补活力评估工作流程，随后评估了具有抗革兰氏阴性病原体活性的内部可用裂解酶LysMK34的安全性特征。卡那霉素作为参考乳房内抗生素也包括在内，也用于对抗 coliform mastitis并评估与LysMK34潜在联合治疗的安全性。LysMK34单独、卡那霉素单独或其联合均未诱导较假处理对照增加的外周细胞死亡。同样，与阴性对照相比，活细胞数或PI强度动力学均未观察到显著差异。总之，这些发现表明LysMK34单独及与卡那霉素联合在测试条件下不对单球体牛乳腺共培养模型产生细胞毒性效应。
LysMK34暴露后无细胞毒性尤为重要，鉴于噬菌体来源enzybiotics作为牛乳腺炎常规乳房内抗菌药物替代或辅助手段的兴趣日益增加。因此，本研究结果为LysMK34可应用于bMEC共培养提供了重要的初步指示。然而，在考虑临床前转化为体内（小鼠和牛）模型之前，仍需进一步研究更长暴露时间、重复给药、炎症反应以及最终体内安全性和有效性。作为未来展望，模型的生理相关性可进一步增强。确实，3D培养工程的持续进展已证明上皮细胞可在可移除牺牲支架模板周围生长以生成具有中心形成的腔的中空球体。更具体地说，Wang等（2017）表明小鼠晶状体上皮细胞可定植于明胶微珠模板化球形腔室，随后去除牺牲微珠产生中空细胞衬里球体。同样，Lewis等（2015） earlier证明原代小鼠肺泡上皮细胞可围绕光降解聚乙二醇（PEG）基微球模板组织，光诱导降解后生成具有中心腔的中空上皮囊肿。将此类方法应用于牛乳腺共培养模型可支持更接近体内腺泡架构的腔形成，同时提供进一步增强乳酪蛋白表达和分泌功能所需的空间组织和顶端-基底极化。尽管如此，这仍有待于永生化bMEC系确立。此外，与前脂肪细胞/脂肪细胞更复杂的共培养——其分泌旁分泌因子增强乳腺球生长，并与催乳素联合刺激bMEC中αS1-酪蛋白合成——可提供进一步增强当前模型生理相关性的途径。然而，应承认在体外完全重现体内泌乳乳腺腺泡本质上受限于完整健康乳房组织中系统性激素 cues、血管化和复杂基质微环境的缺失。在感染背景下，整合（先天）免疫细胞，特别是中性粒细胞和可能的巨噬细胞，可代表向更病理生理相关体外牛乳腺模型用于（革兰氏阴性）乳腺炎研究的重要下一步。研究已描述直接从生乳中回收和表征牛乳来源多形核中性粒细胞和巨噬细胞的方法，提供可能纳入未来共培养系统的生理相关免疫细胞来源。总之，这些改进代表了向更全面的泌乳牛乳腺腺泡体外重建的有前景的未来方向。
总之，本研究进一步优化了先前建立的牛共培养乳腺球模型为可重复的单球体平台，适合纵向监测和候选乳房内治疗药物的临床前安全性评估。适配的96孔ULA配置保留了关键上皮特征，同时通过酪蛋白产生额外证明了分泌相关功能。使用该模型，噬菌体来源裂解酶LysMK34单独及与卡那霉素联合在测试条件下未显示细胞毒性效应，支持其作为乳房内应用潜在抗菌候选药物的进一步研究。
