《ELECTROPHORESIS》：Capillary Electrophoresis Methods for the Characterization of Synthetic Nanoparticles
纳米颗粒（NPs）具有与相同化学组成的块体材料截然不同的性质，其行为与功能同粒径、组成、表面官能团及（表面）电荷等参数内在关联。因此，准确表征上述参数对于理解并优化NPs在涂层、化妆品、防晒霜、药物递送系统及疫苗等多种应用中的性能至关重要。常规的NPs分析表征技术包括基于显微镜、散射、场流分离及色谱的方法，这些方法主要用于粒径测定。红外光谱与核磁共振波谱可提供关于化学组成的系综信息，而对于大于10 nm的NPs，质谱分析仍具挑战性。在较为成熟的技术中，毛细管电泳（CE）因其对粒径、电荷及表面性质的内在选择性，成为NPs表征的一种有吸引力的替代方案。本综述调研了过去七年的文献，以概述并讨论基于CE的NPs分析方法。研究表明，通过适当校准或使用理论模型，CE可提供粒径信息、（表面）电荷及ζ电位。此外，CE可用于评估NP稳定性、组成及其与配体等的相互作用。重要的是，凭借其分离能力，CE能够揭示NP群体内的物理化学异质性，而非仅提供系综平均值。再者，将CE与互补的分离或检测技术——特别是非对称流场流分离（AF4）与单颗粒电感耦合等离子体质谱（SP-ICP-MS）——联用，可构建提供关于NP粒径、组成与电荷正交信息的同时综合分析平台。
1 引言
纳米颗粒（NPs）通常定义为直径介于1至100 nm之间的颗粒。天然NPs如黏土、烟灰或病毒颗粒形成于地质、环境及生物过程。然而，本综述主要关注为特定功能目的而刻意设计的合成NPs的分析。合成NPs涵盖多种材料，通常按其组成可分为聚合物基、金属基及脂质基NPs。聚合物NPs（PNPs）由合成大分子制成，如聚苯乙烯（PS）或聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）。金属NPs通常具有由过渡金属构成的核心，金（AuNPs）与银（AgNPs）为最广泛应用的实例。脂质NPs（LNPs）通常由"脂肪族"化合物组成，如磷脂、胆固醇及可电离脂质。由于其可调的物理化学性质，NPs是高度通用的材料，应用领域广泛，涵盖从表面涂层到防晒霜中的紫外线过滤剂，从化妆品中的抗皱剂到药物载体与控释剂，从诊断分析组分到疫苗递送载体。
NPs的性质不同于构成其的块体材料。此外，NPs表现出超分子特征，如NP粒径、表面官能团及表面电荷密度（SCD）。这些性质通常表现为具有确定均值与宽度的分布，是决定NPs在其周围环境中行为的重要参数。例如，NP粒径与SCD可强烈影响NP稳定性及光学、力学与热学性质、细胞摄取与生物分布。因此，对这些属性进行准确的分析评估对于理解NP性质、功能与行为，以及确保NP基产品的有效质量控制与质量保证至关重要。
NPs的表征通常通过结合基于光谱学、显微镜、电泳和/或色谱原理的不同技术来进行，力求从每种方法获得互补信息。广义而言，这些方法用于评估NP粒径、化学组成或表面电荷。对于NP粒径测定，光散射技术如动态光散射（DLS）或多角度光散射（MALS）常被采用，因其可快速测量溶液中NP样品的平均粒径。在这些方法中，不同尺寸的颗粒同时被分析， yielding样品的总体粒径分布。然而，由于较大颗粒比小颗粒更有效地散射光，它们可能在测量信号中被过度代表，导致粒径偏差，尤其在具有宽粒径分布（PSDs）的样品中。此外，这些散射技术需要相对纯净的样品才能提供可靠的粒径测定，且较不适用于含多种NP群体的混合物。扫描与透射电子显微镜（SEM与TEM）是成熟的粒径测量技术。这些基于图像的技术可实现单个NP的直接可视化，允许测定其尺寸与形状（形貌）。颗粒在真空下分析，液体样品在分析前需干燥。由于NPs通常存在于悬浮液中，干燥过程可能影响其尺寸、形状与质地。此外，EM本质上是一种颗粒计数技术，需要测量非常大量的NPs才能获得统计相关的平均值与PSD。
分离技术在NP粒径测定中扮演相对次要的角色。尺寸排阻色谱（SEC）频繁且广泛地应用于（生物）大分子的尺寸分离；然而，NPs通常过大而无法进入SEC常用固定相的孔道。尽管超宽孔SEC固定相已出现在市场上并显示出潜力，但其整体性能仍有待充分确立。此外，2–5 μm固定相颗粒所能提供的最大孔径存在根本限制。非对称流场流分离（AF4）已被证明可用于（亚）微米颗粒的尺寸分离，并可用于测定NPs的粒径分布。然而，AF4操作并不简单，需要专用设备及经验丰富的操作人员。流体动力学色谱（HDC）利用窄毛细管或非多孔固定相颗粒间通道中层流的抛物线速度分布来实现NPs的尺寸分离。与大分子的SEC类似，HDC通常依赖于使用尺寸标准品构建的、将NP洗脱体积与粒径相关联的校准曲线，然后应用于测定分析物NPs的平均粒径和/或粒径分布。填充柱HDC的操作相当简单，采用常规LC设备，但描述其用于实际NP样品分析的报告仍然稀少。
NPs的化学组成可使用红外（IR）与核磁共振（NMR）光谱等光谱技术评估。这些方法可提供关于构成聚合物材料中官能团、端基及分子架构的信息。IR与NMR技术无损、样品制备要求低，且在分析样品类型方面具有通用性。然而，这些技术通常探测块体样品，因此 yielding关于化学结构的系综平均信息，而不揭示NP群体内的组成分布。质谱（MS）可提供关于聚合物化学组成与结构的详细信息，通常采用基质辅助激光解吸电离（MALDI）或电喷雾电离（ESI）进行。一个主要限制是电离效率取决于尺寸、端基与化学组成，而ESI在很大程度上局限于相对较小且极性的大分子。NPs的MS极具挑战性：10–1000 nm范围内颗粒的直接质量测量不可行，因此需要预先碎裂，例如使用实时直接分析（DART）方法。聚合物NPs的化学组成原则上可通过热解气相色谱（py-GC）评估。在该技术中，物种在分析前通过暴露于高温（500–1400°C）进行热降解。形成的热解产物随后通过GC分析，样品的化学性质则通过分析形成的碎片来推断。然而，从py-GC获得的数据中准确测定化学组成可能具有挑战性，尤其对于共聚物。此外，单体单元的热降解可能发生，使热解碎片归属于原始聚合物结构变得复杂。
NPs的表面电荷在很大程度上取决于NP的化学组成，是影响NP悬浮液在液相中稳定性及其与其他物种相互作用的关键属性。当NP分散于电解质溶液中时，它形成由电解质离子组成的双电层（EDL）。EDL内存在一个滑动（或剪切）面，代表将结合于NP的流体与相对其运动的本体溶液分离的边界。该滑动面处的电势称为ζ电位。该电位是表面电荷密度（SCD）的间接但广泛使用的量度，因此常被用作NP悬浮液的稳定性参数。NP的ζ电位可通过例如流动电位测量与电泳光散射测定，两者均可在Zetasizer等商用系统中实现，便于常规且相对简单的测量。然而，使用这些技术获得的ζ电位值并非总是不含糊的，因为结果强烈依赖于数据评估时所应用的基础理论模型与假设的有效性，而这些模型可能不足以描述所研究的NP系统（进一步解释见第2节）。此外，这些技术用于评估NP群体混合物的适用性通常有限或不明确。
在适用于NP表征的分析技术中，毛细管电泳（CE）占据独特地位：（i）CE是一种分离技术，允许基于颗粒电荷和/或尺寸差异分离NP混合物；（ii）分离在自由溶液中进行，无需与固定相相互作用；（iii）CE可用于测定分离后NPs的尺寸；（iv）原则上，CE允许通过应用适当的数学模型测定NPs的ζ电位。此外，电泳迁移允许NPs从进样样品塞转移至已知组成的背景电解质中，从而在明确受控的条件下进行分析。CE用于NP分析的首篇报道由VanOman与McIntire于1989年发表，他们展示了不同尺寸的带负电聚苯乙烯（PS）NPs的分离。CE分离基于带电物种在填充有背景电解质（BGE）的毛细管中于外加电场下迁移的电泳淌度差异。施加电压后，毛细管中本体液体的电渗流（EOF）可能产生，当使用常见裸熔融石英毛细管时通常指向负极。EOF贡献于NPs的表观迁移，并可抵消其固有电泳淌度，甚至允许在正极性模式下检测阴离子NPs。更详细的解释见第2节。
在本综述中，我们涵盖近期关于CE应用于NP性质评估的研究报道，重点关注重要的物理化学参数，如粒径、（表面）电荷、组成与表面化学。综述涵盖2018年至2025年期间，扩展了Chetwynd等人于2018年初发表的上一篇针对这些主题的概述。我们将首先讨论NPs的CE基本理论，概述NP电泳淌度对NP尺寸与电荷以及BGE离子强度的依赖性。提供总结所涵盖CE方法特征的概览表。随后，基于精选实例，在连续五个部分中，我们论述CE用于基于尺寸的NP分离与NP尺寸测定、用于评估NP ζ电位与SCD、以及用于旨在区分表面化学、测试颗粒稳定性或评估纯度的NP分离。然后我们将单独关注已报道的关于CE与电感耦合等离子体（ICP）MS及AF4联用用于NP表征的研究。结论部分总结CE在NP分析中的优点、前景及一些批判性评注。
2 NPs的CE：基本原理
首先考虑带电物种在电场中的行为，以建立CE的基本电动学概念。当溶解的离子物种（如带电NPs）被置于电场中时，它们将开始以恒定速度向带相反电荷的电极移动。离子的电泳淌度μe（m2·V?1·s?1）通过将其线速度v（m·s?1）除以施加的电场强度E（V·m?1）求得。由于加速离子的电场力被阻碍离子的黏滞力所平衡，因此μe是离子有效电荷q（C）、离子Stokes半径r（m）及介质动态黏度（Pa·s）的函数，根据方程（1）。
EOF的可能存在产生离子的表观电泳淌度，其等于EOF淌度（μeof）与离子μe之和。离子的μe可通过离子迁移时间（tm）与中性EOF标记物迁移时间（teof）利用方程（2）实验求得，其中Ld为毛细管至检测器的长度（m），Lt为毛细管总长度（m），V为施加电压（V）。因此，NP的μe可通过测量其在CE实验中的迁移时间直接测定。值得注意的是，准确的电泳淌度测定要求非电动学相互作用（例如分析物吸附于毛细管壁）可忽略不计。因此应选择实验条件，特别是毛细管表面与BGE组成，使此类相互作用保持在可忽略水平；最小化壁吸附与抑制EOF的策略已在别处综述。
NP通常携带表面电荷，当其被置于电解质溶液中时，将被EDL包围。EDL由带相反电荷离子的固定内层（Stern层）与保持附着于NP并表现出过量带相反电荷离子（未结合于NP表面）的外层流体（扩散层）组成（图1）。在EDL的扩散层内，称为滑动面的边界将随NP运动的流体与周围本体溶液分离。该滑动面处评估的电势定义为ζ电位。该电位在很大程度上支配分散于溶液中的NPs之间的排斥及 thus 其胶体稳定性。
EDL的尺寸随电解质溶液离子强度的增加而减小。EDL尺寸可由Debye长度表示，它是颗粒表面电势延伸至周围介质多远的量度。Debye长度等于1/κ，其中κ为Debye-Hückel参数，其根据方程（3）量化介质及其离子强度的效应，其中为不同离子物种的数量，εr为缓冲溶液的相对介电常数，ε0为真空介电常数（F?m?1），kB为Boltzmann常数（J?K?1），T为绝对温度（K），zi为离子物种i的价电荷数，ni为离子物种i的数密度浓度（m?3），e为基本电荷（C）。应注意该方程仅对高度稀释的对称电解质有效。
NP的μe与其ζ电位相关。对于EDL足够薄（即颗粒半径a远大于Debye长度，使得κa>>1）的颗粒，该关系由Smoluchowski方程（方程4）描述。对于EDL相对较厚（即颗粒半径a小于Debye长度，使得κa<<1）的颗粒，Hückel导出（方程5）。值得注意的是，许多实际NP悬浮液的a值处于Smoluchowski与Hückel方程用于从CE测量的NPs μe值评估ζ电位时将产生不准确结果的范围。多年来，已提出若干通常相当复杂的模型，考虑松弛与表面电导等效应，并在实际相关κa值下更准确地将NP的与ζ电位相关联。关于这些模型的详尽推导，读者可参阅相应文献。Ohshima等人总结了这些模型中哪个对于哪个κa范围（由NP尺寸及电解质类型与浓度决定）及约化电泳淌度最为准确。原则上，从ζ电位可推断NP的SCD（σ），使用基于例如Gouy-Chapman与Grahame模型的方程。Gouy-Chapman理论常用于从ζ电位计算SCD（方程6）。在涉及NPs的CE文献中，SCD一词通常未准确界定其代表滑动面处的电荷密度还是NP表面的本征SCD。一般而言，由CE测量确定的电荷密度与滑动面处的电动学电荷密度相关。然而，所报道的SCD值可能取决于上下文及测量的实际解释。
3 NPs的CE：方法与应用
表1提供了文献中近期报道的用于NPs表征的CE方法概览。方法按所探测的NP性质、所分析的NP类型、CE模式（包括分离条件）及检测方法分类。以下部分重点介绍CE已应用于（i）探测NP尺寸、（ii）测定NP ζ电位与表面电荷密度（SCD）、（iii）分离不同NP群体及（iv）在联用系统如CE–ICP-MS或CE与非对称流场流分离（AF4）联用中分析NPs的精选代表性研究。
3.1 CE用于NP尺寸表征
NP的电泳淌度是其尺寸与电荷的函数。因此，CE原则上可能基于尺寸和/或电荷揭示混合物中NPs之间的差异。本节聚焦于已报道的利用CE实现NPs基于尺寸分离的方法，或通过构建校准线或将CE与单颗粒电感耦合等离子体质谱（SP-ICP-MS）联用。
一种常见方法涉及将测得的电泳淌度（μe）与NP尺寸相关联以构建校准曲线，然后可应用于测定未知尺寸NPs的尺寸。例如，Khatoon等人展示了使用胶束电动色谱（MEKC，CE的一种模式）对银NPs（AgNPs）进行基于尺寸的分离。在MEKC中，通过在BGE中添加高于其临界胶束浓度（CMC）的离子表面活性剂形成胶束的准固定相。施加电压后，这些带电胶束以不同于本体溶液的速度迁移，允许基于分析物在水相与胶束之间不同分配的分离，包括中性物种。在Khatoon等人的研究中，分离使用50 mM三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS）缓冲液（pH 8.7）与35 mM SDS作为BGE，施加电压+20 kV。对于20、60与100 nm AgNP尺寸标准品，电泳淌度与NP尺寸之间呈现线性关系（图2A），绝对电泳淌度随NP尺寸增加。然而，作者未探索其他拟合模型。获得了显著的峰宽差异，较大NPs表现出窄得多的峰；然而作者未讨论该效应的根本原因。AgNPs的常规合成方法通常成本高、耗时且依赖危险化学品。植物基提取物提供了更绿色可持续的替代方案，因其植物化学物质可同时充当还原剂、封端剂与稳定剂。因此，分析了在卷心菜（样品A）与姜（样品B）提取物存在下合成的两个AgNP样品以评估NP稳定性。为验证方法，两个样品均通过MEKC分析，所得尺寸估计与原子力显微镜（AFM）获得的结果比较。在MEKC中，两个样品显示相同的表观迁移时间5.62 min（图2B），对应电泳淌度-21.4 cm2?kV?1?min?1。该淌度值随后使用建立的校准曲线转换为颗粒直径。MEKC获得的尺寸估计与AFM测量显示出良好一致性。样品A的平均直径测定为15.6 nm（MEKC）与14.5 nm（AFM），样品B为15.6 nm（MEKC）与16.0 nm（AFM）。MEKC获得尺寸的相对标准偏差小于1%。结果表明MEKC是测定AgNPs平均尺寸的可行技术，尽管其底层机制尚未完全理解。值得注意的是，SDS胶束直径通常小于10 nm，而NPs通常（远）较大，因此不能分配进入胶束以影响其电泳淌度。更可能的是，带电表面活性剂吸附于NP表面，增加其绝对电荷，如其他地方 also 观察到的。相同组成但不同尺寸的NPs可假定具有相同SCD，其中较大NPs将具有更大总绝对电荷数。这允许观察电泳淌度差异，从而通过MEKC实现NPs基于尺寸的分离。
Fichtner等人而非关注平均粒径，开发了一种CZE方法以测定两个二氧化硅NP样品（SNPs，记为SNP12与SNP22，数字表示供应商报告的标称直径）的NP粒径分布。分离使用硼酸钠BGE（pH 9.2），浓度范围20至60 mM，施加电压+7 kV，毛细管温度15至25°C。一个重要目标是初步测定ζ电位以评估两个SNP样品在不同BGE浓度下的尺寸。SNPs的初始平均尺寸估计通过利用CE设备的Taylor分散分析（TDA）获得。这些尺寸估计连同实验测定的淌度数据随后用于使用Ohshima（2001）模型计算ζ电位，该模型将Em与κa相关联。在所研究尺寸范围（5–25 nm）内，发现ζ电位与颗粒直径无关。对于每个实验条件，通过计算理论电泳淌度作为NP半径在预期尺寸分布范围内的函数构建校准线，假设恒定κ并使用估计的ζ电位（图3A）。然后使用这些校准曲线转换电泳图以获得粒径分布，从中导出平均尺寸、分布宽度与偏度。所得粒径分布针对TEM数据验证，在所有三个参数上显示可比结果（图3B）。然而，作者未解决因依赖二次尺寸表征技术（即TDA）估计ζ电位而产生的潜在限制。这种依赖性可能限制该方法对未知尺寸分布样品或不同组成纳米颗粒的直接适用性。
Mozhayeva等人开发了一种CZE方法并与SP-ICP-MS联用以表征AgNPs。原则上，SP-ICP-MS提供元素组成、粒径分布与颗粒数浓度。在该技术中，以足够低的浓度引入分散良好的金属NP悬浮液，使单个颗粒顺序进入等离子体。每个NP在高温氩等离子体中汽化、原子化与电离，产生离散离子云，以短而强的脉冲到达MS。以短停留时间（通常50–100 μs）的时间分辨模式操作ICP-MS允许区分来自溶解物种的连续背景信号与来自单个NPs的瞬态脉冲。每个脉冲的强度与目标元素的质量成比例，若颗粒组成与密度已知可转换为NP尺寸。脉冲频率反映进入等离子体的NPs数量，允许测定颗粒数浓度与尺寸分布。作者旨在使用CZE按尺寸分离AgNPs混合物，随后进行SP-ICP-MS表征（图4）。BGE由10 mM 3-(环己基氨基)-1-丙磺酸（CAPS）（pH 10）与60 mM十二烷基硫酸钠（SDS）及10 μg?L?1铯组成。在施加电压+20 kV下，CE实现基于尺寸的分离并确保每个MS停留时间仅检测单个NP。该方法能够对每个分离峰通过SP-ICP-MS进行颗粒数浓度定量与NP粒径分布的准确测定。为在保持单颗粒状态的同时增加检测颗粒总数以获得更准确精确的尺寸分布信息，作者开发了反电极极性堆积模式（REPSM）预浓缩策略。在REPSM中，中性分析物在分析前通过将制备于低电导率、无表面活性剂溶液中的大体积样品引入填充有含表面活性剂BGE的毛细管进行预浓缩。施加反向电压后，BGE与胶束的逆迁移在其界面产生堆积区，将分析物浓缩成窄带。一旦电流恢复至典型值的97%–99%，极性切换回标准CE分析。观察到基于尺寸的分离，与Khatoon等人的早期研究一致，表明在所用实验条件下类似的分离机制在起作用。REPSM程序显著改善了检测限（LODs） compared with 常规流体动力学进样。对于20、40与60 nm AgNPs分别获得0.71、0.48与0.67 μg·L?1的LODs，对应14.3、21.0与27.7倍的改善。总体而言，该研究表明CE-SP-ICP-MS是获取金属基NP混合物详细尺寸与浓度信息的有效方法。然而，其适用性限于金属基NPs，因为MS信号必须可与背景区分。碳基NPs如聚合物与脂质基系统由于元素对比度不足而很大程度上不可检测。
3.2 CE用于ζ电位与SCD表征
NPs的SCD与ζ电位是支配其胶体稳定性及其与周围环境相互作用的重要参数。这些性质强烈影响聚集行为、传输现象与界面相互作用。特别是，SCD与ζ电位在决定纳米颗粒在生物系统中的行为方面发挥核心作用，例如通过影响药物应用中的靶向效率与细胞相互作用。
Malburet等人测定了应用于信使（m）RNA疫苗的LNP的SCD。所研究的LNP是一种称为Patisiran的RNA基制剂，由四种脂质组成：可电离脂质（DLin-MC3-DMA）、磷脂（二硬脂酰磷脂酰胆碱；DSPC）、胆固醇与聚乙二醇脂质（DMG-PEG 2000）。为最小化NP吸附于毛细管并获得对称峰，分离使用μSIL-FC涂层毛细管进行，该毛细管涂有中性碳氟聚合物以掩蔽活性硅醇基团。分离在10 mM磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）中进行，施加电压+14 kV，7 mbar毛细管压力，毛细管温度25°C（图5A）。毛细管涂层旨在抑制EOF。然而，分析前毛细管用LNP制剂预饱和以最小化分离期间的吸附。如作者指出，该过程产生动态涂层。此类涂层可能引入表面电荷从而重新引入EOF，如相对快速的中性标记物（12 min）所观察到的。由于施加的共压力对分析物淌度贡献可忽略，LNPs的有效电泳淌度仍可可靠测定。作者未说明共压力的原因，但其可能增加分离稳定性；这是以LNP峰额外峰展宽为代价的。为测定平均LNP SCD，使用基于Ohshima 2001模型的图解测定方法（图5B）首先从CZE（?1.86 × 10?? m2?V?1?s?1）与激光多普勒电泳（LDE）（?5.00 × 10?? m2?V?1?s?1）测量的mRNA负载LNP的电泳淌度确定ζ电位。这分别导致ζ电位为?2.5与?6.5 mV。CZE与LDE衍生ζ电位之间的差异归因于LDE的非分离性质，其允许基质中存在的其他离子影响测量。当NPs的ζ电位超过±30 mV时通常被认为稳定。该LNP测得的ζ电位显著较低；然而，制剂本身的稳定性未被讨论。SCD随后从CZE衍生的ζ电位结合LNP的流体动力学半径推断，后者通过同一仪器的TDA独立测定。从数据估计Patisiran的SCD为?2.4 × 10?3 C?m?2。该SCD在生理条件下相对较低，这是减少人体循环期间非特异性相互作用的理想特征。总体而言，该方法能够测定与NPs稳定性和生物相互作用均相关的关键物理化学参数。
Jalil等人研究了BGE中反离子对不同尺寸SNPs（11.2、15.8与29.6 nm）ζ电位与SCD的影响。分离在硼酸盐缓冲液（pH 9.2）中进行，浓度范围20至120 mM，分离电压+7 kV，毛细管温度25°C。所研究的硼酸盐缓冲液中反离子为Li?、Na?、K?与胍鎓?（Gdm?）。SNPs的ζ电位从测得的电泳淌度（图6A）与颗粒尺寸使用Ohshima模型（2001）的修改版本计算。在该版本中，平均无量纲离子阻力系数替换为反离子的相应值。随后从所得ζ电位导出SCDs。反离子类型与浓度对测定SCDs的影响呈现于图6B。SNPs的CZE衍生SCD值与裸熔融石英毛细管表面的SCD（从测得的电渗淌度测定）进行比较。由于SNP与毛细管具有相似的表面化学，预期可比的SCD值。因此，通过直接比较两个界面获得的SCD可验证修改的Ohshima 2001模型。由于毛细管表面代表平面极限情况，其ζ电位使用Helmholtz-Smoluchowski方程从电渗淌度计算。在多种浓度与反离子类型下，SNP与毛细管表面衍生的SCD值之间获得良好一致性，支持修改模型用于NPs SCD测定的有效性。作者得出结论，在固定离子强度下，胶体稳定性按照Hofmeister序列降低，Li? > Na? > K? > Gdm?，从最不稳定到最稳定，这也从测得峰形的畸变中观察到。这种去稳定作用可用特定离子效应解释，其中离液离子（如Gdm?）更强烈地破坏水合层和/或与表面官能团相互作用，从而削弱NPs之间的静电与水合排斥，而更亲液的离子（如Li?）保留水合层与胶体稳定性。在固定反离子类型与离子强度下，峰畸变取决于SNP尺寸。最大NPs显示最少畸变，而较小NPs显示越来越畸变的峰。此外，发现在所研究范围（20–120 mM）内SCD随离子强度增加而略微增加。观察到的SCD差异与Hofmeister效应一致，归因于离子特异性相互作用，由此BGE中不同阳离子的吸附改变SNP表面的水合状态。
Pyell等人采用CZE测定五种具有不同亲水表面涂层的AuNPs的SCD。十二烷硫醇封端的AuNPs使用聚（异丁烯-alt-马来酸酐）-接枝-十二烷基、聚乙二醇、11-巯基十一烷酸及聚（(2-(甲基丙烯酰氧基)乙基)膦酸）-stat-聚（甲基丙烯酸月桂酯）修饰。CZE分析使用四硼酸钠缓冲液（pH 9.2），浓度范围20至100 mM，+14 kV分离电压，毛细管温度20°C。在通过CZE测定ζ电位及后续SCD之前，NP尺寸通过TDA测定，表明直径在11至34 nm之间。为更好区分BGE中反离子与同离子类型对NP电泳淌度的影响，研究人员修改了Ohshima模型（2001）中的无量纲离子阻力系数，纳入反离子对双电层极化的更大贡献。基于NP尺寸与测得的电泳淌度（图7），评估了ζ电位与SCDs。从ζ电位显示，修改的计算提供了预期范围内的值。AuNPs所得SCDs范围在?3.9 × 10?3 C?m?2至?5.2 × 10?3 C?m?2之间。也观察到SCD随离子强度增加；然而作者指出需要确定这是由于ζ电位测定的不准确还是由于松弛效应的高估。此外，作者将具有非常不同表面化学的纳米颗粒之间SCD值的总体一致性归因于SCD饱和极限的存在，这与反离子凝聚理论一致：超过临界表面电荷，额外电荷被凝聚反离子屏蔽，导致恒定的有效电荷。尽管该现象未被进一步探索，该研究证明CZE是评估具有多样涂层纳米颗粒SCD的通用方法，反映位于颗粒表面附近薄壳中的电荷。
3.3 CE用于NPs分离
除获取NPs尺寸与表面电荷信息外，CE还可应用于质量控制（QC）目的。例如，CE可用于鉴定NP物种与表面化学、评估NP稳定性及评估样品纯度。
LNPs广泛用作治疗剂与疫苗的药物递送系统，例如封装小分子、RNA或DNA。Loughney等人采用毛细管等电聚焦（CIEF）方法测量mRNA负载NPs的等电点（pI），其与表面电荷直接相关。在CIEF中，分析物按其pI分离，pI定义为分析物净电荷为零时的pH。在典型CIEF实验中，毛细管填充有跨越pI值范围的两性电解质混合物。施加电场后，这些两性电解质沿毛细管建立稳定的pH梯度。带电分析物通过该pH梯度向相反极性电极迁移，直至到达pH等于其pI的位置。在该位置，分析物停止迁移，分析物聚焦成锐带，允许与不同pI物种分离。对于检测，聚焦区带在最终 mobilization 步骤中通过检测池，或流体动力学或化学方式。然而，现代仪器能够对分离毛细管的很大部分成像，绕过 mobilization。Loughney等人使用成像（i）CIEF比较用两种不同阳离子脂质（阳离子脂质-1与阳离子脂质-2）配制的mRNA负载LNPs。分离使用分别覆盖pH 5–8与pH 3–10范围的Pharmalyte两性电解质的2:3混合物进行。两种LNP制剂基线分离，表明阳离子脂质组成的差异显著影响pI，其本身是LNP表面电荷的量度（图8）。与单个样品分析相比，两个LNP峰均显示向更高pI值的微小偏移，尽管其根本原因未被研究。虽然分离与pI变化仅定性评估，结果表明iCIEF可用于基于构成阳离子脂质身份区分LNP制剂。观察到LNP样品的表观pI随阳离子脂质与负载mRNA浓度均增加。对阳离子脂质-1与负载mRNA浓度的稀释系列使用iCIEF，发现测得的pI与阳离子脂质-1浓度呈对数相关（对数拟合，R2 = 0.956），与mRNA浓度相关性较弱（R2 = 0.653）。该方法表明LNP表面电荷可使用iCIEF定性评估，LNP的表面电荷主要由表面阳离子脂质支配。
Claude等人利用CE研究柠檬酸盐稳定的AuNPs的稳定性，通过吸光度检测监测表面等离子体共振（SPR）带。SPR带对应金属NPs的局域等离子体共振，其消光带对NP尺寸、聚集及局部介电环境敏感。在其研究中，AuNPs表面通过配体交换反应用硫代葡萄糖苷功能化，有效替换原始柠檬酸盐。所得硫代葡萄糖苷功能化NP（NP-GL）可进一步使用黑芥子酶水解形成高反应性异硫氰酸酯中间体，其随后可在体外与亲核试剂反应，使得能够锚定于生物相关生物分子。分析使用10 mM CAPS与70 mM SDS（pH 10）作为BGE，施加电压+20 kV。研究人员指出，尽管金-柠檬酸盐NPs在水与缓冲溶液中稳定，但在CE分析期间可能在毛细管内变得不稳定。施加的电场可削弱并破坏静电结合的柠檬酸盐层，导致NP聚集。聚集后，吸收带红移：适当分散的AuNPs样品显示520 nm处的带，而聚集体（或团聚体）观察到600 nm处的带（图9A）。提议520与600 nm处观察到的信号强度比值作为NP稳定性的半定量指标。表面柠檬酸盐的配体交换反应也可通过CE监测：原始NP、NP-GL与未反应硫代葡萄糖苷（GL-SH）显示不同迁移时间（图9B）。此外，NP-GL在离线测定中暴露于黑芥子酶，监测对应NP与硫酸根离子的峰面积以评估酶活性并确认NP功能化的完成。这些发现证明CE用于NP质量控制及监测NP开发期间功能化反应的效用。
在生物医学领域，CE用于研究脂质体系统中的药物制剂与封装。Ansar等人展示了带正电未封装多柔比星与其带负电脂质体制剂的有效分离与定量。分离使用含10%（w/v）蔗糖的20 mM磷酸盐缓冲液（pH 6.5），施加电压+30 kV，毛细管温度25°C。蔗糖通过与脂质双层极性头基的氢键相互作用在CZE分离期间稳定脂质体。该相互作用形成强氢键网络并显著增加相变温度，降低膜渗透性，防止脂质体降解并限制未封装多柔比星的泄漏。图10显示未封装多柔比星与脂质体封装药物的分离电泳图。由于分析物携带相反电荷，预期电渗流（EOF）位于两个检测峰之间；然而未包含EOF标记物以确认其位置。这可能解释电泳图中观察到的小肩峰。多柔比星标准品分析确认4.5 min处的峰对应未封装多柔比星，而6.0 min处的峰归因于脂质体药物。未封装部分可使用归一化峰面积直接定量。相反，封装于脂质体内的多柔比星处于结晶状态，导致最大UV吸收波长偏移，产生偏差响应。因此，多柔比星总量通过首先使用中性表面活性剂（Triton X-100）破坏脂质体制剂，随后使用相同CZE方法分析样品来测定。脂质体相关多柔比星的量随后可通过从总药物含量中减去先前测定的未封装部分来计算。该方法表明CZE能够测定未封装多柔比星浓度，并为比较脂质体多柔比星制剂提供有用工具。
CZE也已应用于评估用作药物成分的NP样品的纯度。Pallotta等人使用CE-DAD方法分析制药生产过程中合成的AuNPs。所研究的AuNPs由柠檬酸盐稳定的AuNPs与二硫醇化二乙烯三胺五乙酸（DTDTPA）接枝AuNPs组成。分离使用25 mM硼酸盐缓冲液（pH 8.5）作为BGE，施加电压+10 kV。图11显示通过超速离心（UC）或超滤（UF）纯化NP样品前后取样的两个AuNP样品的CZE分析。这些纯化步骤用于去除残留原料和/或降解产物，也可模拟NP合成后应用的药物制剂下游处理步骤。DAD记录的吸收光谱使得能够区分NP物种与其他（小分子）有机物种，由于AuNPs的特征SPR峰，观察于约520 nm。柠檬酸盐-AuNP样品（图11A）显示多个与杂质相关的峰，而UC纯化后（图11B）观察到对应AuNPs的单个尖峰。对于更复杂的AuNP@DTDTPA样品，未处理样品观察到许多峰（图11C），表明存在多种杂质。五个峰（编号1、3、5、6与8）基于其在520 nm处的吸光度归因于不同AuNP群体，其中峰8因其最高信号被认为是主产物。在该波长处缺乏明确的SPR最大值未被作者讨论。这可能反映小NP尺寸或大聚集体，其SPR带展宽且不明显，以及有机杂质在520 nm处缺乏吸光度，表明仅AuNP群体贡献于观察到的信号。其余峰归因于次要AuNP群体并归类为NP杂质，尽管其确切性质未被进一步表征。UF纯化后（图11D），仅保留少数物种，表明杂质大幅减少，且在520 nm处有吸光度的AuNP群体消失。值得注意的是，仍观察到两个AuNP群体，可能由于NP尺寸或聚集差异，尽管这未被进一步探索。基于214 nm处测得的总峰面积，主产物（峰8）的纯度在UF处理后从45.7%增加至90.4%。这些结果表明CZE可通过分离纳米颗粒群体与共存有机杂质有效评估NP纯度，突显其作为纳米颗粒质量控制工具的价值。
3.4 CE与ICP-MS方法联用用于NP分析
ICP-MS与SP-ICP-MS已广泛用于金属NPs的表征。提供电荷基分离的CZE与提供尺寸与质量选择性的SP-ICP-MS联用产生关于金属NPs的互补信息，并已被证明在生物医学应用中特别有价值。Mozhayeva与Engelhard使用配备鞘流接口的CZE-SP-ICP-MS分析具有不同表面涂层的AgNPs。NP表面涂层由支化聚乙烯亚胺、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）与柠檬酸盐化学组成。CZE分离使用10 mM CAPS与60 mM SDS及10 μg?L?1 CsNO?于水中（pH 10）作为BGE，施加电压+20 kV。采用先前内部开发的针对AgNPs设计的REPSM预浓缩方法以增强检测限。作为实例，图12显示由两个PVP涂覆AgNPs（40与60 nm）与三个柠檬酸盐涂覆AgNPs（20、40与60 nm）组成的五组分混合物的结果。当使用CZE–ICP–MS检测时，观察到若干纳米颗粒群体的部分共迁移（图12A）。然而，SP-ICP–MS检测能够构建三维尺寸–迁移时间热图（图12B），其提供NP尺寸选择性从而提供NP表征。值得注意的是，观察到柠檬酸盐涂覆NPs的基于尺寸的分离，而两个PVP涂覆AuNPs的迁移时间保持不变。柠檬酸盐带负电，贡献于NPs的SCD，柠檬酸盐涂覆AgNPs可额外吸附BGE中的SDS，进一步改变其SCD。当纳米颗粒具有相似SCD值时，分离仍可基于尺寸差异发生。相反，中性与极性PVP涂层可能通过屏蔽NP表面抑制SDS吸附，因为SDS的疏水尾部与带电部分均不能与NP表面强烈相互作用，导致两个PVP涂覆NP尺寸的可比迁移时间。单独SP-ICP–MS无法区分表面化学不同但尺寸相同的纳米颗粒，如40与60 nm PVP与柠檬酸盐涂覆AgNPs。相反，单独CZE无法完全分离40与60 nm PVP涂覆AgNPs与20 nm柠檬酸盐涂覆AgNPs，其在约1100 s处产生共迁移峰。然而，组合CZE–SP-ICP–MS方法能够区分这些群体，突显该互补联用技术的价值。
CE-ICP-MS已用于阐明金属NPs与内源性蛋白质之间的相互作用，以及表征所得表面组成，这些是药物递送应用中的重要特征。这种吸附形成蛋白质冠，即结合于NP表面的蛋白质层。Kruszewska等人研究超顺磁性氧化铁NPs（SPIONs）以研究与生物医学应用相关的NP-蛋白质相互作用。进入血流后，SPIONs可能与血浆蛋白相互作用，导致蛋白质冠形成。该吸附蛋白质层可显著改变NPs的固有物理化学性质、其被免疫系统识别及其与细胞的相互作用。为研究生物学相关条件下SPION表面组成的变化，羧基涂覆SPIONs在10 mM磷酸盐溶液（pH 7.4）中与1 mg/mL人血清白蛋白孵育。CE-ICP-MS/MS分析使用由20 mM碳酸氢铵缓冲液（pH 7.4）与100 mM氯化钠组成的BGE，施加电压18 kV，毛细管温度37°C。检测通过监测56Fe16O?离子作为SPIONs标记物与32S16O?离子进行，后者归因于含硫蛋白质。羧基涂覆SPIONs与白蛋白孵育30 min后，观察到SPION-白蛋白缀合物的形成（图13）。残余硫与游离白蛋白的迁移时间通过单独分析中监测32S16O?离子独立测定，允许其分别归属位置1与2。羧基涂覆SPION的迁移时间（位置3）通过在单独运行中监测56Fe16O?离子测定。孵育后，可观察到新峰（位置4）。同时的56Fe16O?与32S16O?离子信号表明NP-蛋白质缀合物的存在。这些结果表明CE–ICP–MS/MS是研究金属NPs如SPIONs与生物物种之间相互作用及监测复杂介质中纳米颗粒表面组成变化的合适方法。
3.5 AF4与CE联用用于NP分析
使用二维（2D）分离方法的NP表征已通过AF4与CZE的离线耦合展示。在Jing等人的研究中，聚苯乙烯NPs（PS NPs）首先通过AF4基于尺寸分级，之后收集的级分通过采用REPSM预浓缩方法的CZE分析。他们分析标称直径50、100、200、300与400 nm的PS NPs，使用30 mM硼酸钠缓冲液（pH 9.2）作为BGE，+30 kV施加电压，UV检测于200与254 nm。如图14所示，AF4基于尺寸的预分离显著改善分辨率，因为单独CZE无法分离200与300 nm以及50与100 nm的NP对。对于400 nm PS NP获得相对宽的峰。作者将其归因于NPs与AF4洗脱液成分（如去污剂）之间的相互作用，可能增加NP表面电荷的可变性，或归因于与REPSM预浓缩方法相关的过堆积效应。底层机制未被进一步研究；然而，若400 nm PS NP与AF4洗脱液的相互作用是原因，则对其他NP尺寸也应预期类似效应。对于200与300 nm PS NPs均观察到两个不同群体。这些群体被初步归因于表面化学的微小差异或第二颗粒类型的存在。AF4基于尺寸分级后，CZE能够区分尺寸相似但电泳行为不同的纳米颗粒，表明表面电荷的变化。尽管本工作中表面电荷未被定量测定，开发的离线AF4-CZE方法允许同时测定NP尺寸并定性评估尺寸相当NPs的表面电荷异质性。
You等人描述了另一种AF4-CZE方法。在该工作中，PS NPs通过AF4基于尺寸分离，通过CZE基于电荷或（表面）组成分离。在其初始工作中，他们聚焦于20、50与100 nm PS NPs的分离，包括未修饰与羧基化。对于20 nm PS NP，AF4-CZE方法使用10 mM TRIS（pH 10）与60 mM SDS作为BGE，能够在未涂覆与羧基化PS NPs之间实现足够分辨率（图15）。AF4显示洗脱时间明显差异，羧基化PS NPs显著晚于PS NPs洗脱（12.9 min vs. 9.3 min）（图15A）。4 min处观察到的峰可能是归因于基质组分的空峰。作者提出该表观尺寸增加可归因于羧基与水分子之间的氢键，其将增加流体动力学半径，或归因于羧基化颗粒与AF4膜之间增强的相互作用，促进在分离通道壁处更紧密的积累。在CZE中，裸PS NPs比羧基化颗粒迁移更早（图15B）。该行为归因于裸颗粒上较低密度的负表面电荷，导致较低的有效电泳淌度。相反，羧基增加负电荷，导致更高的有效电泳淌度与更晚的迁移时间。当AF4与CZE分别进行时，在两种一维分离中均观察到共洗脱峰。然而，AF4与CE的离线耦合提供裸与羧基化20 nm PS NPs的基线分离（图15C,D）。AF4-CZE分离 also 能够在单独实验中区分裸与羧基化50 nm PS NPs。然而，在该情况下，在CZE中观察到 reversed 迁移顺序，羧基化PS NPs先于裸PS NPs迁移。作者将此与增加数量的羧基抑制SDS吸附相关联，也导致AF4中观察到的相对尺寸差异减小。值得注意的是，该机制解释未对20 nm PS NPs讨论，尽管预期类似表面修饰，表明尺寸依赖性电泳淌度差异。对于100 nm PS NPs，AF4–CE方法未提供裸与羧基化颗粒之间的足够分辨率。这归因于两种纳米颗粒类型之间相对较小的ζ电位差异，如通过滴定与DLS测量测定的。
在后续研究中，You等人分析定制60与100 nm PS NPs，通过在合成过程中调整AA体积以不同量接枝丙烯酸（AA），从而控制表面羧基密度。通过修改羧基密度，研究人员假设较大NPs的分离将变得可行。这与其早期工作中大NPs具有低羧基密度仅表现微小电泳淌度差异导致无可观察分离形成对比。实验使用与先前描述的相同BGE与UV检测（280 nm）进行。开发的AF4-CZE方法能够基于尺寸与表面组成分离60与100 nm PS NP混合物。在AF4中，对于表面接枝30与120 μL AA的两个100 nm PS NPs（分别为100–30与100–120 AA PS NPs），未实现NP尺寸的基线分离（图16A）。在CZE维度中，100–30 AA PS NP比100–120 AA PS NP迁移更慢，这是意外的，因为后者具有更高羧基密度且应更带负电（图16B）。尽管如此，在AF4-CZE分析中这些NPs实现基线分离（图16C,D）。该行为归因于SDS吸附于PS NP表面，其增加有效负表面电荷。该增加对裸PS NPs（100-0 AA）最为显著，其具有最低固有羧基密度并因此在升高的SDS浓度下表现出最高ζ电位。相反，高度羧基化NPs显示较小的ζ电位增加，可能因为带负电羧基之间的静电排斥限制额外SDS吸附。结果，在高SDS浓度下，迁移顺序遵循增加的AA接枝密度，从而增强CZE维度的选择性。此外，You等人通过构建将CZE迁移时间与官能团密度相关联的校准线，对相似尺寸NPs将CZE迁移时间与官能团密度（即与接枝AA量相关）相关联，官能团密度通过电导滴定独立测定。该校准结合一维CZE分离能够定量市售PS NP。该方法对100 nm PS NP显示良好一致性，与电导滴定相比仅4.6%偏差。对于60 nm PS NP观察到较大偏差（10.6%），归因于该尺寸范围内官能团密度分离效率较低。尽管未探索，下一个逻辑步骤是将迁移时间至羧基密度转换直接整合到AF4-CZE分离的CZE维度中。总体而言，该研究证明AF4-CZE联用能够在单一分析方法中同时获得NP尺寸信息并评估NPs的羧基密度或SCD。
4 结论
近期研究表明CE是基于一系列物理化学性质（包括尺寸、组成与表面电荷）分离与表征NPs的有效技术。与常规分析技术如基于液相色谱、光谱学与光散射的方法相比，CE在NPs分析中提供若干固有优势。NPs通常为带电的自由流动物体，使其特别适合电泳分离。此外，CE能够在单一实验中同时分析小分子与NPs，这对于研究制剂与复杂样品基质是有利的。
使用CE的NP尺寸测定已通过使用NP尺寸标准品构建校准曲线或将CZE与SP-ICP-MS联用实现。后一方法提供单独任一技术无法达到的表征水平。此外，CZE获得的电泳淌度数据已用于通过应用适当理论模型计算ζ电位与SCD值。除尺寸与电荷表征外，CZE还能够分离具有（微小）电荷变化的NPs。从应用分析角度，CZE也已成功用于评估NP纯度并通过分离空与载药NPs定量LNP制剂中的药物封装。
将CZE与正交分离或检测技术如AF4或SP-ICP-MS联用进一步扩展其分析能力。在此类联用方法中，电荷或淌度基分离由CE获得，而尺寸信息由AF4或SP-ICP-MS独立获得，使得能够改进复杂或异质NP群体的表征。然而，ICP-MS在很大程度上仍局限于金属基NPs，限制其对有机与碳基NPs的适用性。
对文献的批判性评估表明，许多基于CE的NP研究隐含依赖经验或现象学方法。在若干情况下，NP性质直接从电泳图推断，而未详细理解底层分离机制。特别是，纳米颗粒尺寸与电荷对电泳淌度的联合影响通常未被明确考虑。虽然此类方法在特定条件下可能产生有效分离，但有限的机制洞察引起对稳健性、方法可转移性及在不同实验参数下预测能力的担忧。
总体而言，CE的通用性、分离效率及与互补分析技术的兼容性使其成为跨广泛物理化学参数全面NP表征的有前景工具。进一步进展取决于从主要经验方法开发向更理论驱动的NP在CE中迁移与分离理解的转变。此类进展对于确保在基础研究与质量控制环境中的可靠应用至关重要。
