头孢地尔对马来西亚碳青霉烯耐药Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa及Acinetobacter baumannii的体外活性及耐药机制研究

《Journal of Global Antimicrobial Resistance》：In Vitro Activity of Cefiderocol against Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Acinetobacter baumannii and the Cefiderocol Resistance Mechanisms

　　

摘要：头孢地尔（cefiderocol）是一种新型铁载体头孢菌素，对碳青霉烯耐药革兰阴性菌具有强效体外活性。本研究评估了头孢地尔对马来西亚一家三级教学医院分离的碳青霉烯耐药Klebsiella pneumoniae（CRKP）、碳青霉烯耐药Pseudomonas aeruginosa（CRPA）和碳青霉烯耐药Acinetobacter baumannii（CRAB）的体外活性，并探究其耐药机制。2018至2021年间共回顾性收集448株非重复碳青霉烯耐药菌株，包括150株CRKP、149株CRPA和149株CRAB。最低抑菌浓度（MIC）采用肉汤微量稀释法测定，头孢地尔使用铁缺乏阳离子调节Mueller-Hinton肉汤。通过聚合酶链反应（PCR）检测获得性β-内酰胺酶基因，并对全部22株头孢地尔耐药菌株进行全基因组测序（WGS）。结果显示，头孢地尔对CRKP、CRPA和CRAB的敏感率分别为93.3%、81.9%和96.0%，均高于其他受试抗菌药物。碳青霉烯酶基因blaNDM-1和blaIMP以及超广谱β-内酰胺酶基因blaVEB和blaPER在头孢地尔耐药菌株中被检出。头孢地尔耐药菌株的铁转运体基因中观察到氨基酸替换。研究认为，头孢地尔对碳青霉烯耐药革兰阴性菌仍为有效治疗选择，持续监测和抗菌药物管理对控制耐药菌株的出现与传播至关重要。

研究背景与意义

全球范围内广泛耐药（XDR）和泛耐药（PDR）革兰阴性菌的上升已成为重大公共卫生问题，并与高死亡率相关。Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii和Pseudomonas aeruginosa是引起各类感染的主要病原体。有效抗生素治疗仍是患者管理的关键环节，但碳青霉烯耐药性的日益流行导致治疗选择有限、临床结局不佳，马来西亚亦不例外。CRKP的出现在全球迅速增加，其机制包括碳青霉烯酶产生、孔蛋白丢失、外排泵过表达、青霉素结合蛋白（PBP）改变以及较少见的质粒介导AmpC β-内酰胺酶过表达。A. baumannii每年约引起一百万例感染，其中约50%涉及多重耐药菌株；CRAB通过靶点修饰、外排泵、酶灭活和通透性缺陷获得耐药。黏菌素（colistin）仍是关键治疗选择，但受新兴耐药和毒性限制；替加环素（tigecycline）对A. baumannii显示体外活性，但因分布容积大、血清浓度低，在血流感染和严重肺部感染中临床应用受限。碳青霉烯类仍是P. aeruginosa的关键治疗选择，而CRPA通过金属β-内酰胺酶产生、外排泵过表达、AmpC β-内酰胺酶过表达和OprD表达降低表现耐药。根据2024年世界卫生组织细菌重点病原体清单（WHO BPPL），CRKP和CRAB为关键优先病原体，CRPA为高优先级，凸显对新治疗策略的迫切需求。头孢地尔是2019年获美国食品药品监督管理局（FDA）批准的新型铁载体头孢菌素，通过利用铁转运系统并靶向PBP-3，对碳青霉烯耐药革兰阴性菌显示强效体外活性。然而，头孢地尔体外评价具有挑战性，因其铁载体介导的摄取需要铁缺乏条件，使静态药敏评估与动态药代动力学/药效学（PK/PD）暴露的解读复杂化。美国、欧洲和日本的研究显示良好活性，但马来西亚数据有限。因此，研究人员开展本研究，旨在评估头孢地尔对马来西亚一家三级教学医院CRKP、CRAB和CRPA分离株的体外活性并探究其潜在耐药机制，为当地临床用药与耐药监测提供依据。

关键技术方法

研究回顾性收集2018至2021年马来西亚大学马来亚医疗中心（UMMC）诊断实验室448株非重复碳青霉烯耐药菌株（150株CRKP、149株CRPA、149株CRAB），并按常规VITEK 2系统判定碳青霉烯耐药，随机选取各菌种约150株用于头孢地尔药敏试验。最低抑菌浓度（MIC）按2024年美国临床和实验室标准协会（CLSI）M100-Ed34指南以肉汤微量稀释法三倍复测，头孢地尔采用铁缺乏阳离子调节Mueller-Hinton肉汤（CAMHB）。以PCR筛查超广谱β-内酰胺酶基因家族及菌种特异性碳青霉烯酶基因、孔蛋白相关基因和铁载体摄取相关基因。对全部22株头孢地尔耐药菌株（16株P. aeruginosa、5株A. baumannii、1株K. pneumoniae）行全基因组测序（WGS），采用Illumina NovaSeq 6000平台、CLC Genomics Workbench组装、RAST注释、RGI 6.0.3与CARD 4.0.0预测耐药基因，并与参考菌株比较pbp3及铁转运体基因序列；采用PubMLST确定序列型（ST），并以CSI Phylogeny 1.4基于核心基因组单核苷酸多态性（cg-SNP）构建系统发育树。

研究结果

3.1 碳青霉烯耐药菌株的人群与临床分布：通过病历资料回顾分析显示，三种菌约半数分离自≥60岁老年患者，儿童（<18岁）最少见，男性居多；民族分布以马来裔和华裔占比最大；CRKP主要与定植相关，CRPA定植与感染近乎均等，CRAB更多与感染相关；标本来源上CRKP多见于直肠/肛周拭子，CRPA多见于呼吸道和伤口/软组织标本，CRAB多见于呼吸道和气管分泌物标本。

3.2 CRKP菌株的药敏与β-内酰胺酶基因特征：通过肉汤微量稀释法测定显示，所有碳青霉烯类及β-内酰胺复合制剂对CRKP的MIC₅₀均≥16 μg/mL；头孢地尔敏感率最高（93.3%），其次为替加环素（92.0%），阿米卡星为82.0%。MIC分布显示90%以上CRKP对头孢地尔敏感（MIC≤4 μg/mL），而头孢他啶-阿维巴坦（CZA）、亚胺培南-瑞来巴坦（I-R）和头孢洛扎-他唑巴坦（C/T）分布更偏向高MIC。基因检测显示150株CRKP中110株（79.3%）检出碳青霉烯酶基因，82株（54.7%）携带bla_NDM、41株（27.3%）携带bla_OXA-48；最常见组合为bla_CTX-M-1、bla_TEM与bla_NDM（33.3%）；79.3%菌株同时携带三种孔蛋白基因，20.7%至少丢失一种孔蛋白。

3.3 CRPA菌株的MIC分布与耐药模式：通过药敏试验显示，头孢地尔敏感率最高（81.9%），其次为阿米卡星（71.1%），β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂（BL-BLI）组合敏感率为54.4%至57.7%。头孢地尔MIC分布明显偏向低浓度，1 μg/mL占比最高（23.5%），MIC>32 μg/mL者不足1.0%；三种对照药物则多以MIC>32 μg/mL占比最高。基因检测显示最常见基因为bla_OXA-50（55.0%），149株中45株（29.5%）检出碳青霉烯酶基因，33株（22.2%）携带bla_NDM、13株（8.7%）携带bla_IMP；96.0%菌株携带至少一种头孢地尔耐药相关基因（pirA、piuA、piuD）。

3.4 CRAB菌株的药敏与β-内酰胺酶基因谱：通过药敏试验显示，替加环素敏感率最高（98.7%），头孢地尔次之（96.0%）；98.0%菌株对黏菌素表现为中介，2.0%完全耐药。头孢地尔MIC主要集中于0.5 μg/mL（约36.0%）和1 μg/mL（约37.0%），90%以上菌株MIC≤4 μg/mL。基因检测显示98.7%的CRAB至少携带一种获得性OXA碳青霉烯酶基因，最常见为bla_OXA-23与bla_TEM（62.4%），其次为bla_OXA-23（33.6%），2株（1.3%）同时携带bla_NDM-1和bla_OXA-58。

3.5 头孢地尔耐药菌株的全基因组测序分析：通过按β-内酰胺酶基因型分层分析显示，携带bla_OXA-48的CRKP中仅4.9%对头孢地尔非敏感，而bla_NDM阳性者中为11.0%；CRPA中bla_NDM阳性者非敏感率达72.7%、bla_VEB阳性者为54.6%，而bla_IMP产菌仅15.4%。对22株头孢地尔耐药菌株（1株CRKP、16株CRPA、5株CRAB）行WGS显示，除头孢地尔外所有菌株对BL-BLI均耐药（MIC>32 μg/mL）；22株中17株检出bla_NDM-1，11株检出bla_PER/VEB。序列分析显示三种菌的pbp3均无氨基酸替换；唯一CRKP耐药株K4在铁转运体cirA基因存在氨基酸替换。CRAB耐药株分属ST2、ST25、ST164、ST643，同一ST菌株的铁转运体相关基因变异一致；CRPA耐药株分属ST357（10株）、ST308（5株）和ST235（1株），同一MLST菌株的目标基因序列无差异。基于cg-SNP的最大似然系统发育分析显示16株CRPA聚为三个主要序列型簇，ST357与ST308各自紧密聚集，提示同一序列型菌株间亲缘关系密切，ST357克隆在医院内多年持续存在，但系统发育数据本身不能确定单次暴发或直接传播。

讨论与结论

讨论部分指出，头孢地尔对CRKP的体外活性与多项研究一致，MIC₉₀≤4 μg/mL，本研究敏感率93.3%、耐药率0.7%；携带bla_NDM的CRKP头孢地尔MIC较高，与SIDERO-CR研究一致，但bla_NDM单独存在未必导致耐药，可能与其他机制共同作用。CRPA中头孢地尔耐药率10.7%，高于既往报道，可能与东南亚地区NDM和VEB产P. aeruginosa频发有关；多数耐药CRPA同时携带bla_NDM和bla_VEB，提示二者可能叠加降低头孢地尔敏感性；ST235分离株检出bla_IMP-26，该基因在多项研究中与头孢地尔敏感性下降相关；ST357菌株检出bla_OXA-10，与既往报道一致，但多种耐药决定因素共存使其贡献呈多因素性。CRAB中头孢地尔耐药率4.0%、MIC₉₀为2 μg/mL，与全球监测数据相符；bla_OXA基因与头孢地尔MIC升高无明确关系，但携带bla_NDM或bla_PER的CRAB菌株MIC>32 μg/mL，提示这些β-内酰胺酶可能降低头孢地尔敏感性。所有菌株pbp3均无氨基酸替换，提示本研究耐药并非由所检测的pbp3替换所致；耐药CRPA和CRAB的铁转运体基因在同一MLST内高度保守，虽存在轻微序列变异，但与头孢地尔MIC无明确关联，提示铁转运体变异在本研究菌株中可能不起主要作用。研究优势为448株非重复菌株、四年跨度、标准化肉汤微量稀释法和明确折点；局限在于WGS仅针对耐药菌株，缺乏敏感对照，难以判定所发现遗传特征是否特异与耐药相关，且耐药菌株数量较少，统计效能有限，遗传学发现应视为初步关联而非确定机制。研究结论为：头孢地尔仍是抗碳青霉烯耐药革兰阴性菌的有效治疗选择；本研究中头孢地尔对携带金属β-内酰胺酶和丝氨酸碳青霉烯酶的分离株显示良好抗菌活性；随着头孢地尔获批临床使用，持续监测和抗菌药物管理对监控和控制耐药菌株的出现与传播至关重要。