《Journal of Hazardous Materials》：Pangolin scales as a potential retrospective biomonitoring matrix for environmental and rescue-associated chemical exposures in endangered wildlife
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穿山甲（Pholidota: Manidae）是专性食蚁哺乳动物，分布于亚洲和非洲的热带及亚热带地区。它们对蚂蚁和白蚁的特化捕食提供了重要的生态系统服务，通过调节社会性昆虫种群，并作为生态系统工程师驱动土壤生物扰动。尽管具有生态重要性，穿山甲在过去一个世纪经历
穿山甲（Pholidota: Manidae）是专性食蚁哺乳动物，分布于亚洲和非洲的热带及亚热带地区。它们对蚂蚁和白蚁的特化捕食提供了重要的生态系统服务，通过调节社会性昆虫种群，并作为生态系统工程师驱动土壤生物扰动。尽管具有生态重要性，穿山甲在过去一个世纪经历了剧烈种群下降，主要由奢侈消费和传统医学需求驱动的过度开发所致，尤其是对角蛋白鳞片的需求加剧了大规模偷猎和灭绝风险。目前，所有八种穿山甲均被列入世界自然保护联盟（IUCN）红色名录，状态从易危到极危不等。除了直接开发，人为活动的化学污染代表了一个潜在重大但尚未充分研究的环境压力源，其中新兴有机污染物（emerging organic contaminants, EOCs）尤为令人担忧。EOCs是通过再生水灌溉、生物固体施用和农用化学品输入进入农业土壤的合成及天然化合物，这些土壤充当EOCs的长期汇。一旦沉积，这些污染物可能持续存在、积累并通过土壤无脊椎动物进入食物网。作为蚂蚁和白蚁的专性消费者，穿山甲可能通过这一营养途径暴露于EOCs，并在穴居过程中通过偶然土壤摄入和皮肤接触产生额外暴露。这种风险对于栖息地与农业景观高度重叠的种群可能尤为显著。表征野生穿山甲的EOC暴露对于评估其化学负担和相关健康风险至关重要，但其极危状态限制了常规侵入性采血或内部组织取样的可行性。因此，需要非侵入性采样方法进行可靠的EOC评估。角蛋白化基质作为稳定的生物档案库，能在长时间内隔离污染物。穿山甲鳞片原则上可从活体和死亡个体非侵入性收集，易于保存，使其成为野生种群长期EOC监测的实用且符合伦理的基质。此外，从死亡个体回收或执法查获的鳞片通常缺乏来源记录。鉴于角蛋白化基质反映累积化学暴露的潜力，穿山甲鳞片中的EOC图谱可能提供个体暴露历史的回顾性见解。然而，据研究人员所知，尚无经验证的解析方法用于从穿山甲鳞片中提取和定量EOCs，这代表了对此濒危物种进行系统性化学暴露评估的方法学空白。可靠的EOC提取需要跨不同理化性质化合物的广谱回收率。在可用提取方法中，QuEChERS（快速、简便、廉价、有效、耐用、安全）已被广泛采用。改进的QuEChERS方案已成功应用于从人发和指甲等角蛋白化基质中提取EOCs，支持其对成分相似的穿山甲鳞片的适用性。然而，致密且吸收性的角蛋白基质可能阻碍溶剂渗透和污染物回收，复杂的基质组成需要严格净化以最小化共萃取干扰和基质效应。因此，需要进行方法特异性优化以建立稳健可重复的提取性能。在样品提取后，需要一个能够同时进行广谱筛查和准确定量的分析平台。高分辨质谱（high-resolution mass spectrometry, HRMS），包括液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC-QTOF/MS）和Orbitrap系统，能在单次分析运行中实现目标分析、可疑筛查和非靶向筛查。本研究旨在：（1）开发和验证一种改进的QuEChERS提取方法，结合LC-QTOF/MS，用于穿山甲鳞片中EOCs的综合可疑筛查和靶向定量；（2）应用经过验证的工作流程表征野生穿山甲的EOC暴露图谱，并评估代表对比暴露场景的个体间成分差异；（3）评估死后穿山甲鳞片中的EOC图谱是否能提供与先前暴露背景相关的回顾性化学信息，包括记录不完整或缺失的标本。台湾穿山甲（Manis pentadactyla pentadactyla）被选为模型系统，因为通过台湾既定的野生动物救援网络可获得跨越对比暴露场景的机会性死后鳞片样本。共有18个此类样本使用开发的工作流程进行了分析，为穿山甲鳞片中的EOC生物监测提供了概念验证。
一、研究背景与科学问题
穿山甲（Pangolins, Pholidota: Manidae）是专性以蚂蚁和白蚁为食的哺乳动物，在调节社会性昆虫种群和驱动土壤生物扰动方面发挥着关键的生态系统功能。然而，由于对其鳞片用于奢侈品和传统医药的巨大需求，所有八种穿山甲均已被列入世界自然保护联盟（International Union for Conservation of Nature, IUCN）红色名录，状态从易危到极危不等。除了直接的过度开发，来自人类活动的化学污染，特别是新兴有机污染物（Emerging Organic Contaminants, EOCs），构成了一个潜在重大但研究不足的环境胁迫因素。EOCs可通过再生水灌溉、生物固体施用和农用化学品输入进入农业土壤，并经由土壤无脊椎动物进入食物网。作为专性消费者，穿山甲可能通过食物链、偶然的土壤摄入以及在穴居过程中的皮肤接触而暴露于多种EOCs。然而，迄今为止，关于野生穿山甲体内EOC负荷的经验数据完全空白，其化学暴露特征也未得到描述。由于穿山甲的极危状态，常规的血液或内部组织侵入性采样受限，亟需一种非侵入性或低侵入性的监测方法。角蛋白化的毛发、指甲等基质已被证明是稳定的生物档案库，能长期封存污染物。穿山甲的鳞片同样由角蛋白构成，理论上可以非侵入性地从活体或死亡个体获取，且易于保存。更重要的是，从死亡个体或执法查获的鳞片往往缺乏来源记录，若能从中提取化学暴露信息，则有望实现回顾性溯源。基于此，该研究旨在填补方法学和知识空白，首次探索穿山甲鳞片作为回顾性生物监测基质的潜力。该研究成果发表于国际知名期刊《Journal of Hazardous Materials》。
二、主要关键技术方法
为开展此项研究，研究人员首先建立了针对穿山甲鳞片基质的EOC分析方法。主要技术方法包括：
- 1.
改良QuEChERS提取法：研究人员对经典的QuEChERS（Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe）方法进行了优化，调整了样品与提取剂的比例，并结合分散固相萃取（dispersive Solid Phase Extraction, dSPE）净化步骤，以有效从致密的角蛋白基质中提取广谱EOCs。
- 2.
液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术：采用液相色谱-四极杆飞行时间质谱（Liquid Chromatography-Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry, LC-QTOF/MS）进行分析，该技术兼具高分辨率和高质量精度，能同时进行可疑筛查和靶向定量。
- 3.
可疑筛查与靶向确认策略：首先利用包含超过3700种EOCs的数据库进行可疑筛查，对匹配度高的化合物进行初步鉴定。随后，对筛选出的优先EOCs使用标准品进行靶向确认和定量。
- 4.
样本来源：共计18份来自台湾地区死亡的野生穿山甲（Formosan pangolin, Manis pentadactyla pentadactyla）的鳞片样本，这些样本通过野生动物救援组织于2021至2023年间收集，并根据案例史分为“救援组”、“野外组”和“未知历史组”。
三、研究结果
3.1. 改良QuEChERS-LC-QTOF/MS方法的建立
研究人员使用四种覆盖较宽极性范围（logP值从-0.13到3.16）的同位素标记标准品对提取方法进行优化和验证。优化后的方法在500 μg kg-1和1000 μg kg-1两个加标水平下，回收率分别为71.08%-82.11%和78.60%-90.96%，相对标准偏差（Relative Standard Deviation, RSD）均低于8.80%。该方法符合欧盟SANTE指南的残留分析标准，证明了其从穿山甲鳞片中提取广谱EOCs的适用性。
3.2. 穿山甲鳞片中EOCs的可疑筛查
通过LC-QTOF/MS分析并结合四个数据库的检索，研究人员在所有18个样本中初步鉴定出58种EOCs，置信度为Level 2a。这些化合物涵盖六大类：药物（25种）、工业化学品（11种）、个人护理产品（9种）、农药（6种）、天然产物（5种）和违禁药物（2种）。检测结果显示显著的个体间差异，其中氯己定、恩诺沙星和吲哚-3-乙酸等少数化合物检出频率较高，而大部分化合物仅在单个个体中检出。主坐标分析（Principal Coordinates Analysis, PCoA）和层次聚类分析（Hierarchical Cluster Analysis, HCA）揭示了三个主要聚类，其中“救援组”个体倾向于聚为一类，其特征是共同检出治疗性药物（如恩诺沙星、环丙沙星和美洛昔康）。
3.3. 靶向分析
研究人员选取了9种优先EOCs进行靶向确认和定量分析。其中8种（环丙沙星、克拉霉素、恩诺沙星、氟虫腈、异噁唑草酮、美洛昔康、氧氟沙星和四环素）被成功确认。方法验证显示，仪器检测限（Instrument Detection Limits, IDLs）为0.1-1.6 pg，基质效应在-8.0%至85.0%之间，加标回收率和精密度均满足要求，方法检测限（Method Detection Limits, MDLs）为0.1-2.0 μg kg-1。定量分析结果表明，“救援组”个体的药物浓度显著高于“野外组”，例如，在救援个体P03中检出了高达15400 μg kg-1的恩诺沙星，且恩诺沙星与代谢物环丙沙星的浓度比（1.2:1至16.3:1）与已知的药代动力学特征一致，表明这是救援过程中兽医用药的直接证据。相比之下，“野外组”个体中检出的药物浓度较低，且缺乏典型的药代动力学模式。值得注意的是，在一个幼年个体（P16）中检出了极高浓度的氟虫腈（12200 μg kg-1），提示可能存在高强度、局部的农药暴露源，如食用受污染的猎物或经母乳传递。
四、讨论与结论
讨论部分总结：研究结果表明，野生穿山甲确实暴露于源自农业、生活污水和工业排放的多样化化学污染物。鳞片中的EOC图谱能够区分不同的暴露情境：高浓度的抗生素-抗炎药组合及其特定的代谢比例是救援相关临床用药的独特标志；而低浓度的零星检出则更可能反映了环境背景暴露。对于“未知历史组”的个体，通过靶向定量分析，研究人员能够将其化学图谱与“救援组”或“野外组”的模式进行比对，从而为其可能的生前经历提供线索。例如，P17个体因含有高浓度的恩诺沙星和环丙沙星而被推断可能曾接受过兽医治疗。此外，在一个幼年个体中发现的极高浓度氟虫腈，强调了评估不同发育阶段农药暴露风险的重要性。
研究结论翻译：尽管穿山甲保护的全球紧迫性日益凸显，但野生穿山甲的化学暴露特征在很大程度上仍未得到表征。本研究开发并验证了一种改良的QuEChERS-LC-QTOF/MS工作流程，用于穿山甲鳞片中EOCs的可疑筛查和靶向定量，为该物种提供了首个经验性EOC评估。该方法在覆盖广泛极性范围的八种确认目标EOCs上实现了稳健的回收率（70-120%）、高精密度（RSD≤20%）和痕量级灵敏度（MDLs=0.1-2.0 μg kg-1）。将该方法应用于18只死亡的野生台湾穿山甲的鳞片，可疑筛查得到了58个Level 2a置信度的注释，涵盖六大化学类别。靶向定量确认了八种优先EOCs，浓度范围从痕量级到高浓度的药物和农药检出。值得注意的是，在一个幼年个体中观察到的显著升高的氟虫腈浓度，值得进一步调查穿山甲的农药暴露途径和毒理学相关性。EOCs的成分和定量模式在不同案例史组的个体间存在差异，为进一步评估鳞片相关化学图谱与救援或暴露背景之间的关联提供了基础。这些发现支持将穿山甲鳞片作为一种潜在的回顾性生物监测基质进行进一步评估，特别是对于那些记录不完整或无法获取的标本。未来的研究需要更大的样本量和更广的地理覆盖范围，以建立种群水平的EOC基线，并且专门的生态毒理学研究应评估混合物毒性和慢性多途径EOC暴露对穿山甲的健康后果。这项工作为穿山甲提供了一个经过验证的分析框架和首个经验性EOC暴露数据集，为整个鲮鲤科（Manidae）的保护、康复和化学暴露评估奠定了基础。
