《Advanced Science》：CKMT1 Counteracts VDAC1 Oligomerization-Induced Neuronal Pyroptosis Through Steric Hindrance in Ischemic Stroke
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缺血性卒中（ischemic stroke）是全球死亡和残疾的主要原因之一，然而有效的治疗方案仍然有限。线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）向胞质的泄漏是缺血性脑损伤的关键驱动因素。定位于线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道1（volt
缺血性卒中（ischemic stroke）是全球死亡和残疾的主要原因之一，然而有效的治疗方案仍然有限。线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）向胞质的泄漏是缺血性脑损伤的关键驱动因素。定位于线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道1（voltage-dependent anion channel 1, VDAC1）通过寡聚化促进mtDNA泄漏。然而，缺血性卒中中VDAC1寡聚化的调控机制仍知之甚少。该研究表明，缺血性卒中促进VDAC1寡聚化，导致mtDNA泄漏，激活黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2, AIM2）炎症小体，并随后引起神经元焦亡（pyroptosis）。使用VBIT-4药理学抑制VDAC1寡聚化可有效阻断这一级联反应。研究人员将线粒体肌酸激酶1（creatine kinase mitochondrial 1, CKMT1）鉴定为VDAC1寡聚化的新型内源性抑制剂。CKMT1通过双区域协同机制抑制VDAC1寡聚化。具体而言，CKMT1的N端结构域（第75位精氨酸和第121位谷氨酸）与VDAC1的C端结构域（第218位精氨酸和第189位谷氨酸）形成稳定界面，而CKMT1信号肽（第1-39位残基）通过空间位阻阻碍VDAC1二聚化，从而阻断寡聚化。此外，神经元过表达CKMT1可显著减轻神经元凋亡（apoptosis），而CKMT1敲低则加剧神经元损伤。总之，这些发现表明CKMT1通过抑制VDAC1–mtDNA–AIM2轴保护脑缺血损伤，并将CKMT1鉴定为缺血性卒中的新型治疗靶点。
缺血性卒中（ischemic stroke）是由脑动脉闭塞引起的疾病，占所有卒中病例的70%以上，是全球死亡和残疾的主要原因之一。尽管再灌注治疗对挽救缺血半暗带至关重要，但可能诱发脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury, CIRI），其机制涉及兴奋性毒性、能量代谢障碍、氧化应激和炎症免疫反应，目前仍缺乏有效干预手段。线粒体功能障碍在缺血性卒中中起关键作用，其中线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）泄漏至胞质被视为缺血性脑损伤的重要驱动因素。电压依赖性阴离子通道1（voltage-dependent anion channel 1, VDAC1）定位于线粒体外膜，其寡聚化可促进mtDNA泄漏，但缺血性卒中中调控VDAC1寡聚化的分子机制尚不清楚。线粒体肌酸激酶1（creatine kinase mitochondrial 1, CKMT1）位于线粒体膜间隙，与VDAC1和腺嘌呤核苷酸转运体（adenine nucleotide translocase, ANT）形成复合物维持ATP稳态，但其在缺血性卒中的作用未知。为此，研究人员开展本研究，揭示了CKMT1通过空间位阻抑制VDAC1寡聚化从而保护缺血性脑损伤的新机制，成果发表于《Advanced Science》。
研究人员采用雄性Sprague-Dawley大鼠（8周龄，250-280 g，购自北京HFK Bioscience）建立大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型，并利用原代皮层神经元-星形胶质细胞共培养及PC12细胞氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation, OGD）模型模拟体外缺血。主要技术方法包括：免疫沉淀联用液相色谱-质谱（co-immunoprecipitation coupled with liquid chromatography-mass spectrometry, Co-IP/LC-MS）鉴定VDAC1相互作用蛋白；化学交联结合免疫印迹检测VDAC1寡聚化；qPCR定量胞质mtDNA；免疫荧光和共定位分析；AlphaFold结构预测与分子对接；构建截短和点突变体验证结合位点；脑室内注射腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）实现神经元特异性CKMT1过表达；TTC/Nissl染色及行为学实验评估脑损伤。
2.1 缺血性卒中通过促进VDAC1寡聚化介导的mtDNA泄漏加重神经元损伤。MCAO大鼠和OGD细胞模型显示，缺血导致线粒体嵴破坏、胞质mtDNA增加和VDAC1寡聚化增强；VDAC1寡聚化抑制剂VBIT-4可减少mtDNA泄漏并提高细胞活力。
2.2 OGD介导的胞质mtDNA泄漏通过AIM2炎症小体激活触发神经元焦亡。染色质免疫沉淀-qPCR显示mtDNA富集于AIM2复合物；乙锭溴铵清除胞质mtDNA后，AIM2-ASC共定位及消皮素D（gasdermin D, GSDMD）、caspase-1活化水平均降低。
2.3 抑制VDAC1寡聚化在体内通过减少mtDNA泄漏减轻神经元焦亡。VBIT-4预处理可减少MCAO大鼠胞质mtDNA、梗死体积及焦亡蛋白表达；si-VDAC1与VBIT-4比较表明，VDAC1寡聚化而非表达水平是mtDNA泄漏所必需。
2.4 VDAC1相互作用蛋白的鉴定。通过IP/LC-MS、GO富集、STRING网络及文献比对，筛选出CKMT1为核心候选蛋白。
2.5 缺血性卒中上调CKMT1和VDAC1表达，并诱导CKMT1高分子量复合物解聚。CKMT1在再灌注24 h达峰，VDAC1和焦亡蛋白在72 h达峰；Native PAGE显示OGD后CKMT1八聚体稳定而高分子量复合物解聚。
2.6 MCAO/OGD后CKMT1与VDAC1相互作用增强。免疫共沉淀和免疫荧光共定位证实二者结合增强。
2.7 CKMT1直接且特异性地与VDAC1相互作用。外源共表达、截短突变和点突变实验确定CKMT1的N端结构域（第46-132位氨基酸）为结合区域，第75位精氨酸和第121位谷氨酸为关键残基；AlphaFold预测其与VDAC1的第218位精氨酸和第189位谷氨酸形成盐桥。
2.8 CKMT1通过空间位阻抑制VDAC1寡聚化。CKMT1敲低加剧VDAC1寡聚化和mtDNA泄漏，过表达则抑制；催化失活突变体C317G仍保留抑制功能，而缺失第1-39位氨基酸（信号肽）则丧失抑制能力，证明信号肽介导空间位阻效应。
2.9 神经元特异性过表达CKMT1减轻体内缺血性脑损伤。AAV介导的CKMT1过表达减少梗死体积、AIM2和焦亡蛋白水平及神经元损伤，并改善运动功能。
讨论部分指出，VDAC1寡聚化是多种疾病中mtDNA泄漏和炎症的关键机制。本研究发现CKMT1通过“双区域协同”机制抑制VDAC1寡聚化：N端结构域与VDAC1 C端结合，第1-39位氨基酸信号肽在空间上阻断VDAC1二聚化。CKMT1在缺血后早期代偿性升高，但不足以对抗持续的VDAC1寡聚化，外源过表达可有效保护神经元。研究结论表明，CKMT1通过直接与VDAC1相互作用并抑制其寡聚化，减少mtDNA泄漏和AIM2炎症小体介导的神经元焦亡，从而保护脑缺血损伤。这些发现从功能和结构角度确立了CKMT1作为脑缺血损伤的有前景的治疗靶点，并为针对CKMT1-VDAC1复合物的靶向治疗提供了精确的分子框架和新的策略见解。
