单步免试剂电化学适配体传感器：面向生理浓度褪黑素的直接、未提取血浆检测

《Advanced Science》：Single-Step Electrochemical Aptasensor for Melatonin Detection in Unprocessed Plasma

　　

褪黑素是诊断昼夜节律睡眠障碍(CRSDs)以及监测癌症、代谢与心血管疾病、精神障碍相关昼夜节律紊乱的重要临床生物标志物。研究人员报道了一种基于电化学适配体(E-aptasensor)的生物传感器，可在生理浓度范围内对褪黑素进行直接、免试剂检测。该传感器采用优化表面密度的适配体，基于构象变化检测机制，在较宽动态范围内实现褪黑素检测，覆盖皮摩尔级生理区间。适配体结合行为在 bulk 溶液与计算机模拟中分别通过荧光共振能量转移(FRET)与分子对接(MD)验证。该电化学适配体传感器可实现高灵敏、高选择性褪黑素检测，检测限(LOD)达0.75 pM，并对多种相关干扰物表现出强特异性；将电化学响应按 Hill–Langmuir(HL)结合模型拟合，得到表观电化学解离常数(Kd, app)为37 pM。值得注意的是，该传感器在未萃取人血浆中表现良好，避免了免疫分析通常所需的样品提取步骤。上述特性支持其在昼夜节律睡眠障碍诊断与监测中的快速褪黑素分析，并有望推动未来即时诊断(Point-of-Care)应用。这种单步电化学适配体传感器为金标准技术提供了更快、更简便的替代方案。

研究背景与问题提出

褪黑素(N-acetyl-5-methoxytryptamine, MLT)由脑内松果体分泌，受昼夜节律系统调控，日间血浓度低于2 pg/mL（约8 pM），夜间升至30–80 pg/mL（约130–350 pM）。暗光下褪黑素上升的起点（DLMO）是评估人体内源性昼夜相位金标准，可用于延迟睡眠相位障碍、轮班障碍等 CRSDs 的诊疗。现有检测依赖 HPLC、LC-MS/MS、RIA、ELISA 等：前者仪器昂贵、流程复杂；后者多需样品萃取、多步孵育，且抗体易与结构类似物交叉反应，造成高估。临床亟需一种准确、灵敏、快速、单步、适用于复杂基质且可走向床旁的褪黑素检测平台。

论文发表于《Advanced Science》，研究人员构建并优化了一种单步、免试剂的电化学适配体传感器(E-aptasensor，基于电化学适配体 E-AB 架构)，以甲基蓝(MB)标记褪黑素适配体固定于自制金工作电极(GWE)上，利用靶标结合引发的构象变化调制界面电子传递，实现方波伏安(SWV)读取。结论显示：在缓冲液中 LOD 为0.75 pM，K_{d, app}为37 pM；在未提取人血浆中可直接定量，血浆内 LOD 达0.49 pM，K_{d, app}为57 pM，并对相关干扰物具备实用选择性，为 CRSDs 快速相位分型与居家监测提供可行路径。

主要关键技术方法

研究人员采用两条褪黑素适配体序列 C1 与截短体 A2，通过 FRET（Cy3/Cy5 标记）在溶液中验证靶标诱导构象变化，并以分子对接/分子动力学(MD)模拟定性解析结合界面；将 MB 标记适配体固定在丝网印刷/增材制造自制 GWE 上，用 SWV 读取峰电流；通过调节适配体表面负载密度把响应窗口移至生理浓度；以 Hill–Langmuir 模型拟合得到表观亲和力与灵敏度；样本来自 Brigham and Women’s Hospital 睡眠与昼夜节律团队提供的 RIA 预标定未提取人血浆队列，并做干扰物单独/混合选择性测试与稳定性评估。

研究结果

2 Results and Discussion

研究人员先用 FRET 证明 C1、A2 在结合褪黑素后供受体距离增大、受体荧光下降，A2 变化更显著；乱序序列无响应。MD 模拟显示 C1 结合能更低、结构更稳，A2 更具柔性但结合界面可维持。电化学端比较 C1（3′端 MB）、C1m（中段 MB）、A2（5′端 MB），A2 线性范围最宽、K_{d, app}最优；Laviron 分析显示靶标结合后表观电子传递速率由88 s^?1升至123 s^?1，信号源于适配体-靶标互作而非假象。SWV 频率优化约100 Hz。

随后调控表面种群：减小 GWE 尺寸与缩短固定时间不根本改变机制；将适配体固定浓度由100 nM 降至25 nM 可将响应窗平移至约1 pM–3 nM 生理区间，12 nM 因电流逼近仪器噪声而失效。选定25 nM、1小时固定用于生理窗口检测。

分析性能上，25 nM A2 在生理区间 HL 拟合 K_{d, app}=37 pM，线性区灵敏度0.98，LOD 0.75 pM。选择性测试中，5-羟色胺单独有响应，但含褪黑素混合体系仍可清晰区分；乱序探针无有效信号。未提取血浆中，以50 nM A2 做矩阵匹配校准，9例 RIA 标定样本剂量依赖明确，K_{d, app}=57 pM，LOD 0.49 pM，无需萃取。稳定性上，传感器在4、25、37°C 存10天后仍保留大部分信号，37°C 衰减最明显；在人工血清/组织间液不同黏度与温度下仍可工作；CV 证实 MB 为表面受限氧化还原种，且兼容商用便携恒电位仪。

3 Conclusion（结论翻译）

当前 CRSDs 与昼夜节律失衡的临床诊断仍多依赖睡眠日记与体动记录等非特异指标；褪黑素分析虽为金标准，却需连续采样与严苛前处理。研究人员展示的 E-aptasensor 基于成熟 E-AB 框架，可在未提取血浆中以单步、免试剂电化学读出定量褪黑素。通过筛选结构切换型 A2 适配体、优化 MB 标记位置与表面种群，平台在生理区间达到皮摩尔级表观灵敏度，并对目标干扰面板具备实用分辨力；FRET 与分子模拟支撑了构象切换机制。基于 RIA 标定未处理样本的矩阵匹配校准，传感器可直接在未萃取血浆中可接受精度定量，避开免疫分析所需萃取。初步稳定性实验显示跨条件留存良好。该工作将 E-AB 框架拓展至生理浓度褪黑素的直接检测，兼容便携仪器，为快速、时间分辨褪黑素画像与 CRSDs 长期监测提供临床转化基础；未来将面向床旁与居家场景推进系统集成、降低批次差异并研究再生复用。

讨论总结

讨论部分强调：表观 K_{d, app}不等同于溶液 K_d，而是受表面密度、探针动力学与读取参数共同影响的传感器参数；A2 的线性构象与5′端 MB 赋予更大结合位移，是性能优于茎环 C1 的关键。血浆中因提高至50 nM 固定浓度以抵消电极间波动，中点右移但依旧可用。单步、无试剂、无萃取是直接临床价值核心；当前归一化仅为概念验证校正，后续需标准化电极与传感层、改进基线处理。研究未涉及再生与多通道阵列，留待未来 POC 集成。整体意义在于把高灵敏褪黑素检测从实验室萃取流程推向可便携、可纵向采样的 circadian medicine 前端工具。