单毛细管打结形开放微流控探针：基于常压质谱成像的稳健多功能的空 间多组学分析

《Advanced Science》：A Single-Capillary Open Microfluidic Probe for Robust and Versatile Spatial Multi-Omics Using Ambient Mass Spectrometry Imaging

组织分子构筑（从代谢物和脂质异构体到天然蛋白质）的高分辨率空间映射仍然是常压质谱成像（MSI）的核心挑战。现有方法通常依赖多毛细管、对对准敏感的液体提取探针，损害了稳健性和与结构分辨空间组学的兼容性。研究人员通过引入由单根毛细管制造的整体打结形开放微流控探针（Knot-probe）来缓解这一权衡。Knot-probe实现了40 μm扫描方向空间分辨率和高达0.16 mm s^?1的采集通量，却可在约30 min内用标准实验室工具制造，并可靠运行超过一个月。在不牺牲传统空间脂质组学和代谢组学的前提下，Knot-probe实现了结构分辨空间组学，通过串联质谱（MS）提供磷脂酰胆碱sn-位异构体的高分辨率成像，并在气动辅助变体中实现蛋白质和蛋白质形式的天然MSI，其通量和灵敏度均高于无气动辅助的探针。这些能力源于集成的打结几何结构，该结构确保稳定的微液体结用于局部提取，具有最小化采样足迹和高效质量传递，同时消除复杂探针对准以实现稳健操作。Knot-probe易于与标准电喷雾电离（ESI）MS集成，弥合了传统常压MSI与新兴结构空间组学之间的差距，为多样生物和化学应用提供了广泛可及的方法。

**研究背景与意义**

质谱成像（MSI）是一种变革性技术，能够直接从生物标本中无标记地可视化数百种生物分子，基于软电离技术的MSI空间组学为完整脂质、代谢物和蛋白质提供空间分辨的 profiling。然而，常规MSI空间组学工作流程主要在分子式水平报告总和组成信息，而不解析分子结构特征，如脂质异构体的结构多样性或天然蛋白质构象和蛋白质形式。这些结构变异体往往具有不同的生物合成途径、空间分布和特定生物学角色。因此，亟需将传统的基于分子式的空间组学与结构分辨空间组学相结合，将分子异质性与结构信息联系起来。基质辅助激光解吸/电离（MALDI）仍是主流MSI平台，但其对基质应用和变性条件的需求限制了某些结构细节和天然状态蛋白质组学的获取。作为补充方法，常压液体提取MSI（如解吸电喷雾电离（DESI）和纳喷雾DESI（nano-DESI））能够在大气条件下直接成像天然生物分子，样品制备 minimal 且提取溶剂选择灵活。然而，要实现这些优势并常规采用，需要在分析能力与操作稳健性之间取得优化平衡。实现常压液体提取MSI多功能性的关键在于采样探针，其设计 critical 地决定空间分辨率、采集通量和操作稳健性。当前探针往往面临分析性能与操作稳健性之间的权衡：提供高分析性能的探针制造和操作复杂，而更易获取的探针提供有限的多功能性。缓解这一性能-稳健性权衡对于充分利用常压液体提取MSI的独特优势至关重要。研究人员从新兴开放微流控系统汲取灵感，报道了一种理性设计的单毛细管开放微流控探针，具有打结形结构，称为Knot-probe。该创新打结几何结构促进了稳定、小液体结的形成，这是高质量成像的关键，同时消除了复杂的探针对准。整体单毛细管设计简化了制造（约30 min）、操作和维护，实际使用寿命超过一个月。研究人员通过组织切片中脂质和代谢物的高空间分辨率和高通量成像验证了Knot-probe的稳健性能。除传统空间组学外，Knot-probe还实现了通过串联MS的磷脂酰胆碱（PC）sn-异构体分辨成像，以及 notably 蛋白质和蛋白质形式的天然MSI——这是常压MSI结构分辨空间组学的两个新兴核心能力。通过将开放微流控的优势与稳健、直接的设计相结合，Knot-probe为生物和化学研究中传统和先进结构空间组学的常压MSI提供了可及的途径。该论文发表在《Advanced Science》。

**关键技术方法**

研究人员开发了基于单根熔融石英毛细管的多步火焰弯曲和研磨工艺制造Knot-probe，采用两种配置：Type 1直接接口MS用于脂质和代谢物成像，Type 2气动辅助变体用于天然蛋白质MSI。MSI平台包括注射泵、XYZ平移台、微定位器和数字显微镜，探针与Q Exactive Focus Orbitrap MS或Orbitrap Fusion Tribrid MS耦合。组织样本为C57BL/6小鼠脑和睾丸切片（10 μm厚），经冷冻切片和真空干燥处理。脂质和代谢物成像使用90%甲醇作为提取溶剂；串联MSI使用90%乙腈含5 mM NH₄HCO₃和0.5% NH₄OH；天然MSI使用200 mM乙酸铵。数据处理使用MSConvert、imzML Converter、SCiLS Lab和MASH Native软件，脂质和代谢物通过LIPID MAPS和HMDB数据库匹配（质量误差<5 ppm），蛋白质通过on-tissue天然top-down MS/MS和UniProt数据库搜索鉴定。

**研究结果**

**Knot-Probe的设计**：Knot-probe是一种集成紧凑装置，可随时耦合到质谱仪用于常压MSI。分析物通过探针的开放采样端口从样品切片连续提取到溶剂中，并转移到喷雾发射器进行电喷雾电离。制造基于单根熔融石英毛细管，通过多步火焰弯曲和研磨工艺成形。四个设计特征使Knot-probe成为高效稳健的常压MSI设置：打结几何结构减小了探针底端的曲率半径，产生更小的采样端口横截面和更小的液体结，促进高空间分辨率成像；探针可直接与MS接口（Type 1）或 facilely 修改为气动模块（Type 2）用于蛋白质天然MSI；整体单毛细管设计消除了不同毛细管的精确对准需求，简化组装和更换；制造无需专业微加工技术，约30 min内用标准实验室工具完成，使用寿命超过一个月。三名具有常规MS经验的操作人员经过培训，线扫描的总离子流在三组实验中显示良好重现性，证明了Knot-probe的可及性。

**脂质和代谢物的高空间分辨率成像**：研究人员通过小鼠脑和睾丸切片的长时间高空间分辨率脂质成像验证了Knot-probe的性能。连续三次扫描，每次约11 h，跨越两天无探针堵塞。探针电离稳定性通过信号丢失像素比例评估，在选定离子图像中低于3.7%。Knot-probe提供高灵敏度，单像素内所有成像脂质峰的平均信噪比（S/N）为285。在小脑冠状切片中，富含颗粒层的PG 34:1和PG 44:12、富含分子层的PS 36:2和富含白质的SHexCer 42:1;O3被清晰区分。在脑矢状切片中，观察到小脑颗粒层、分子层和白质的类似区分，海马齿状回颗粒细胞层和CA3锥体层也被分辨，PI 38:4信号显著增强。小鼠睾丸切片中，圆形生精管和多边形间质区域的互补分布被观察到，PI 40:6信号在生精管间显示异质分布。通过计算信号从最大跨度的20%增至80%的距离，获得扫描轴方向40 μm的空间分辨率。从脂质组学角度，Knot-probe在脑和睾丸切片中分别成像了138和98种脂质，覆盖负离子模式下m/z 500?1000范围内的四个脂质类别和13个亚类，与常规nano-DESI探针和拉流探针的报告覆盖相当。脑切片显示PS和LPS、PE和LPE、PA、SHexCer和HexCer丰度较高，而睾丸切片显示(L)PI、(L)PG和脂肪酸丰度较高。代表性小分子代谢物高空间分辨率图像显示，牛磺酸在全切片高丰度，天冬氨酸和黄嘌呤在后脑增强，N-乙酰天冬氨酸在小脑分子层增强，FA 20:1在白质增强。总共122种推定小分子代谢物在负离子模式下成像。

**Knot-Probe与高通量采集的兼容性**：研究人员在不同采集参数下展示了Knot-probe的操作稳健性。通过匹配溶剂流速与样品扫描速度，可在不改变探针配置的情况下进行高空间分辨率或高通量模式成像。在160 μm s^?1扫描速度下，相对于高空间分辨率成像通量增加4.3倍，较高溶剂流速（2 μL min^?1）确保分析物从采样端口到MS入口的更快转移。在该扫描速度下获取的离子图像未显示明显信号拖尾。尽管高扫描速度下获取的像素数减少，生物分子的空间保真度与高空间分辨率成像一致。PS 38:4和SHexCer 42:2;O2在脑矢状切片中观察到类似空间模式，均在小脑白质中显著富集。改变样品扫描速度未引入脂质覆盖、强度或总体组成谱的实质偏差。两种采集模式共享高度相似的代表性单像素质谱和可比的脂质覆盖，分别推定 assigned 138和105种脂质，其中102种共享，占高空间分辨率和高通量实验总强度的92%和97%。主要脂质类别的相对丰度在两种采集模式间一致。

**通过串联MS的磷脂酰胆碱sn-异构体分辨成像**：研究人员展示了Knot-probe通过高空间分辨率串联MSI区分甘油骨架上不同脂肪酸酰基sn-位的PC异构体。通过向提取溶剂中掺杂碳酸氢铵，PC的碳酸氢盐加合物的高能碰撞解离（HCD）MS/MS通过自由基导向碎裂产生sn-1特异性碎片离子，离子强度可用于半定量sn-位异构体。以PC 34:1为例，on-tissue HCD MS/MS of [PC 34:1+HCO₃]^?产生两个碎片离子，对应sn-1 16:0链（m/z 419.26）和sn-1 18:1链（m/z 445.27），以及m/z 699.50离子指示H₂CO₃和(CH₃)₃N的中性丢失。两个sn-1特异性碎片离子的存在表明小鼠脑冠状切片中PC 16:0/18:1和PC 18:1/16:0异构体共存。获得良好碎片离子信号，单像素S/N高达150。串联MSI揭示小鼠小脑中异构体的不同分布，两种异构体在灰质中比白质更丰富。基于均方根归一化碎片离子强度的半定量分析显示，PC 18:1/16:0对PC 16:0_18:1异构体的贡献在灰质中较高（约31%），在白质中较低（约10%）。对于PC 36:1，两对异构体PC 16:0_20:1和PC 18:0_18:1通过相应sn-1特异性碎片离子成像，饱和sn-1酰基链的PC 18:0/18:1和PC 16:0/20:1异构体显示较高丰度。PC 18:0/18:1和PC 18:1/18:0的空间分布在整个脑切片中变化不大，而PC 20:1/16:0的碎片离子在灰质中显示明显更高强度。对于PC 34:2，两对PC 16:0_18:2和PC 16:1_18:1异构体通过相应sn-1特异性碎片离子成像，PC 16:0/18:2和PC 16:1/18:1最丰富。PC 16:0/18:2和PC 18:2/16:0分别在白质和灰质中略有富集，而PC 16:1/18:1和PC 18:1/16:1在脑切片中分布相对均匀。

**使用气动辅助Knot-Probe的蛋白质和蛋白质形式天然MSI**：天然MS是结构生物学的使能技术，旨在气相中保留折叠蛋白质结构和非共价相互作用。常压液体提取MS提供温和采样环境，非常适合直接从组织进行蛋白质天然MSI。研究人员将Knot-probe适配为气动辅助Type 2配置，以测试相同的整体采样几何结构是否能支持具有有用灵敏度、空间细节和通量的天然蛋白质MSI。虽然Type 1 Knot-probe对脂质和代谢物表现出满意性能，但在使用非变性200 mM乙酸铵作为提取溶剂时产生很少可检测的天然蛋白质信号。研究人员假设改善去溶剂化将导致蛋白质离子信号恢复。在发射器处加入基于三通的气动模块提供气体辅助，成功恢复蛋白质检测。离子显示窄电荷态分布（4+至6+），表明在气动辅助电喷雾和适当源解离电压（SDV）下成功保留天然样紧凑蛋白质构象。相反，使用50%甲醇/0.1%甲酸和0 V SDV获取的对照质谱移至更宽电荷态包络（7+至13+），而100 V SDV减弱蛋白质信号。进行on-tissue天然top-down MS/MS以鉴定检测的蛋白质。具体而言，m/z 1652.8（6+）离子鉴定为酰基辅酶A结合蛋白（ACBP），检测的蛋白质形式携带N端甲硫氨酸切除和乙酰化，去卷积平均质量为9911 Da。m/z 1691.1（5+）和m/z 1713.9（5+）离子分别鉴定为C端截短泛素（?GG）和聚泛素链1?76。天然MSI生成清晰分辨的蛋白质特异性离子图像。ACBP和截短泛素显示 largely 互补的空间模式，而泛素在切片中分布更均匀。截短泛素离子信号在海马齿状回更明显，而ACBP离子信号在丘脑更突出。相对于最近需要3 μm s^?1扫描速度的高分辨率nano-DESI天然MSI实验，Knot-probe在本研究中以26 μm s^?1操作，在天然成像条件下通量高得多。

**讨论与结论**

Knot-probe为常压液体提取MSI提供了高性能、稳健且易于获取的解决方案。与先前的nano-DESI探针相比，Knot-probe绕过了毛细管对准和定位的复杂过程，简化了制造（约30 min）、操作和维护，实际使用寿命超过一个月。Knot-probe在多方面具有多功能性：传统空间脂质组学和代谢组学的高空间分辨率和高通量采集，以及先进结构分辨空间组学，包括磷脂酰胆碱异构体的串联MSI和蛋白质及蛋白质形式的天然MSI。这些结果提供了用单一常压MSI模式实现空间多组学的前景，不仅补充了MALDI MSI不可及的化学空间，还减少了对仪器资源和样品兼容性的依赖。由于Knot-probe易于耦合到ESI MS仪器，它在整合表面采样、反应筛选和空间成像于单一探针平台的应用中具有前景。将Knot-probe与探针-样品距离控制的主动反馈系统集成可进一步扩展其适用于表面形貌不平整的样品。总体而言，Knot-probe拓宽了常压MSI的范围，为在多样生物和化学研究中更广泛采用传统和结构分辨空间多组学提供了实用途径。