《Advanced Science》：Engineered Chiral Probiotics Ameliorate MASH via Gut–Liver Axis
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代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）的全球流行态势持续加剧，而有效治疗手段仍然匮乏。本研究鉴定出肠道共生菌Faecalibacterium duncaniae（F. duncaniae）的显著耗竭是MASH的核心特征之一。为克服传统益生菌在炎症环境中定植能力
代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）的全球流行态势持续加剧，而有效治疗手段仍然匮乏。本研究鉴定出肠道共生菌Faecalibacterium duncaniae（F. duncaniae）的显著耗竭是MASH的核心特征之一。为克服传统益生菌在炎症环境中定植能力不足的问题，研究人员将手性金纳米酶（chiral gold nanozymes）锚定于F. duncaniae表面，构建了一种活性微生物治疗制剂。研究发现其生物学性能呈现对映体依赖性：右手性纳米酶（D-Au）作为优越的活性氧（ROS）清除屏障，保护益生菌免受氧化应激损伤，并增强其在炎症肠道中的定植能力。在MASH小鼠模型中，该工程化益生菌（F@D-Au）逆转了疾病进展，改善了肝脏脂肪变性、炎症及纤维化。该制剂还恢复了全身稳态，纠正了肠道菌群失调、代谢紊乱以及MASH相关认知功能障碍。代谢组学分析揭示，这种多器官获益与关键微生物代谢物的恢复相关，包括犬尿喹啉酸（kynurenic acid）和亚油酸（linoleic acid）。本研究建立了一类手性增强型活体治疗制剂，可精准重塑肠-肝轴，为治疗MASH及其并发症提供了变革性策略。
**研究背景与问题**
代谢综合征患病率的持续攀升使代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）成为全球最常见的慢性肝脏疾病。其进展形式MASH可进一步发展为肝硬化和肝癌，预计将成为肝移植的首要适应证。然而，当前MASH的有效治疗选择极为有限，Resmetirom的近期获批虽具有里程碑意义，但仍凸显了治疗手段的匮乏以及开发机制迥异的新策略的迫切性。肠-肝轴被认为是MASH的核心驱动因素：肠道菌群紊乱可损害肠道屏障功能，促进肠源性炎症信号传递至肝脏，加剧肝脏炎症。在慢性代谢性疾病背景下，持续性肝脏炎症常伴随全身低度炎症状态，与多系统异常密切相关。因此，恢复肠道稳态和减轻肠-肝炎症信号被视为综合干预的有前景策略。益生菌因其公认的促进健康效应而成为治疗肝脏疾病的有前景选择。部分细菌菌种（包括F. duncaniae）已证实可通过增强肠道屏障完整性和调节脂质代谢过程发挥肝脏保护作用。然而，像F. duncaniae这样的厌氧益生菌对胃肠道中的氧化应激高度敏感，限制了其治疗潜力，靶向递送益生菌仍是一项重大挑战。近年来，纳米级药物递送平台因其降低不良反应、提高生物利用度以及实现控释或缓释的潜力而备受关注。金纳米颗粒（AuNPs）因其表面反应性、低毒性和生物活性特征尤为引人注目。手性金纳米颗粒（c-AuNPs）代表了一类新型纳米酶，可模拟细胞内酶系统以对抗氧化应激，在胃肠道环境中尤为有效。
**研究概况与结论**
本研究通过对MASH患者与健康受试者肠道微生物群落的比较评估，发现MASH组存在显著菌群失调，Faecalibacterium属丰度大幅降低。基于此，研究人员构建了手性金纳米酶修饰的益生菌系统（F@D-Au），旨在调控肠-肝轴并逆转MASH进展。研究结果表明，AuNPs具有超氧化物歧化酶（SOD）样和过氧化氢酶（CAT）样酶模拟活性，能有效清除ROS，减轻氧化应激及相关炎症。右手性纳米酶（D-Au）保护F. duncaniae免受氧化应激并促进其肠道定植。在MASH小鼠模型中，F@D-Au系统发挥了显著的肝脏保护作用，包括清除ROS、减少氧化损伤、抑制炎症细胞因子表达，并逆转肝脏病理改变。肠道菌群测序显示，F@D-Au干预显著降低了Firmicutes/Bacteroidota比值至接近健康对照水平。机制分析表明，F@D-Au的保护作用与色氨酸和亚油酸代谢通路的重编程相关。在色氨酸通路中，F@D-Au治疗增加了犬尿喹啉酸和褪黑素水平，与MASH病变缓解及MASH相关认知功能障碍改善相关。在亚油酸通路中，F@D-Au干预升高了磷脂酰胆碱和亚油酸水平，与肝脏代谢表型改善相关。总之，该研究揭示了MASH患者存在显著肠道菌群失调，并开发了手性纳米酶-益生菌杂合体F@D-Au，在鼠类MASH模型中展现了显著疗效，不仅逆转了组织病理学和恢复了代谢健康，还改善了认知缺陷。本研究引入了一种融合手性纳米医学与合成微生物学的平台技术，为通过肠道微生物组靶向复杂多系统疾病提供了有力且通用的策略。论文发表在《Advanced Science》。
**关键技术方法**
研究人员开展了以下主要关键技术方法研究：（1）人类队列粪便样本16S rDNA高通量测序，用于筛选MASH相关差异菌群（MASH患者9例，健康对照7例，来源于中山医院伦理批准的临床队列）；（2）手性金纳米酶（L-Au/D-Au）的合成与表征，采用透射电子显微镜（TEM）、圆二色谱（CD）、紫外-可见吸收光谱及Zeta电位分析；（3）工程化益生菌F@L-Au和F@D-Au的构建，通过氨基化聚乙二醇功能化及酰胺偶联反应将纳米酶共价锚定于细菌表面，并采用TEM元素映射和能量色散谱（EDS）验证；（4）体外细胞实验（HT29肠上皮细胞）评估纳米酶抗氧化保护效应，包括ROS检测、脂质过氧化、DNA损伤（γ-H2AX）及蛋白羰基化分析；（5）CDHFD诱导的C57BL/6J小鼠和SD大鼠MASH模型，进行为期8周的口服治疗干预；（6）行为学测试（Morris水迷宫和新物体识别测试）评估认知功能；（7）16S rRNA基因测序和非靶向代谢组学（LC-MS）分析肠道菌群及粪便/血清代谢物变化；（8）体内荧光成像和qPCR定量评估工程化益生菌的肠道定植与滞留。
**研究结果**
**2.1 MASH与健康个体的肠道微生物组特征**：通过16S rDNA测序对16例参与者（7例健康，9例MASH）粪便样本分析，发现MASH患者α多样性指数显著改变，β多样性PCoA分析显示两组菌群结构明显分离（PERMANOVA p=0.003）。LEfSe分析鉴定出Faecalibacterium属在MASH患者中显著减少，热图和定量分析进一步证实其相对丰度显著低于健康对照。基于上述证据及F. duncaniae已知的抗炎、产丁酸及改善认知等特性，选择其作为后续MASH干预研究的候选益生菌菌株。
**2.2 工程化手性益生菌的设计与表征**：研究人员合成了L-Au和D-Au手性金纳米酶，TEM显示其为均匀单分散球形颗粒，直径2–5 nm，平均3.4 nm。CD光谱显示L-Au在220 nm处为负峰而D-Au为正峰，证实其手性特征；UV-vis吸收光谱和Zeta电位几乎一致，表明表面手性是两者唯一区别。F. duncaniae呈杆状，长约1500–2000 nm。由于纳米酶和细菌均带负电荷，通过氨基化聚乙二醇功能化后经酰胺偶联反应将纳米酶共价锚定于细菌表面。TEM元素映射和EDS分析证实Au成功锚定于工程菌表面，成功构建F@L-Au和F@D-Au系统。
**2.3 手性纳米酶活性及抗氧化应激性能测定**：采用SOD和CAT检测试剂盒测定不同浓度手性金纳米颗粒的酶模拟活性，证实两种手性金纳米颗粒均具有ROS清除能力且呈浓度依赖性，其中D-Au显示出比L-Au更强的ROS清除活性，呈现对映体依赖性抗氧化性能。
**2.4 L-Au和D-Au对LPS诱导细胞成分损伤的保护作用**：CCK-8实验显示L-Au和D-Au对HT29细胞毒性低（细胞活力>80%）。CLSM显示手性金纳米酶可高效内化进入细胞且L-Au与D-Au内吞效率无显著差异。LPS刺激导致细胞内ROS显著升高，L-Au或D-Au均显著抑制ROS生成。D-Au减轻细胞内氧化应激、防止脂质过氧化，显著减少γ-H2AX形成保护DNA免受氧化损伤，并降低蛋白羰基化水平，效果优于L-Au。手性金纳米颗粒显著降低LPS刺激肠上皮细胞上清中TNF-α、IL-1β和IL-6浓度。
**2.5 口服给药后F@L-Au和F@D-Au的生物安全性评估与肠道定植评价**：健康C57BL/6小鼠灌胃不同浓度L-Au和D-Au后，血清生化指标和主要器官H&E染色与对照组无显著差异，表明口服具有良好的生物相容性。F. duncaniae在模拟胃液中生长缓慢、模拟肠液中中等、改良培养基中最快。在SGF（4 h）和SIF（8 h）共培养中，L-Au和D-Au包覆细菌的存活率均优于未包覆细菌，D-Au包覆组存活率最高。体内荧光成像显示灌胃24 h后荧光信号主要定位于结肠，MASH小鼠信号明显强于健康小鼠；F@D-Au在MASH小鼠中荧光信号最高。离体荧光成像显示MASH小鼠灌胃F@L-Au和F@D-Au后可检测到肝脏信号，ICP-MS证实肝组织中可检测到低量金元素，两组间无显著差异，表明金纳米酶组分可部分脱落并穿过受损肠屏障到达肝脏。qPCR绝对定量显示F@D-Au组结肠黏膜F. duncaniae载量最高。
**2.6 F@D-Au可改善CDHFD诱导的C57小鼠MASH**：采用CDHFD喂养16周诱导C57小鼠MASH模型，治疗组包括L-Au、D-Au、F、F+D-Au、F@L-Au和F@D-Au。F@D-Au治疗显著减轻CDHFD诱导的体重增加（较模型组降低>10%），空腹血糖和胰岛素水平最接近对照组，GTT和ITT显示F@D-Au组葡萄糖代谢和胰岛素敏感性改善。F@D-Au显著逆转CDHFD升高的门静脉血清LPS水平，降低血清ALT和AST水平，改善血脂参数。H&E、Masson三色、Oil Red O和Sirius Red染色显示F@D-Au显著减轻肝脏脂肪变性、炎症、肝细胞气球样变和纤维化。F@D-Au显著降低肝脏和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平及血清CRP水平，降低肝脏TC、TG和羟脯氨酸水平，减少肝脏MDA和TBARS水平。
**2.7 F@D-Au显著改善MASH小鼠认知功能**：Morris水迷宫显示MASH小鼠找到平台时间较长，F@D-Au口服8周后逃避潜伏期显著缩短，效果优于其他治疗组；测试期中MASH小鼠跨平台次数少、平台停留时间短、入台潜伏期长，F@D-Au治疗后显著改善。新物体识别测试显示F@D-Au组对新物体的探索时间、辨别指数和偏好指数更高。机制上，F@D-Au组Evans蓝渗漏和血清S100β浓度最低，表明减轻BBB损伤。免疫荧光显示F@D-Au降低海马GFAP标记强度（减轻星形胶质细胞活化）、增加MAP2荧光强度（保护神经元结构完整性）、增加SYN-1和PSD95共定位（提高突触密度）、减少IBA-1阳性小胶质细胞内CD68表达。ELISA显示F@D-Au降低海马组织TNF-α、IL-1β和IL-6水平。
**2.8 F@D-Au改善MASH及相关认知障碍的机制洞察**：16S rRNA基因测序显示F@D-Au组与对照组α多样性无显著差异，但与MASH组有显著差异；PCA显示F@D-Au组菌群结构与对照组更接近。门水平上F@D-Au增加Bacteroidota丰度、降低Firmicutes比例，F/B比值接近健康对照。非靶向代谢组学PLS-DA显示F@D-Au组代谢谱与对照组接近；火山图显示F@D-Au组较MASH组上调1480种、下调836种代谢物。KEGG通路富集显示色氨酸代谢通路明显重塑，F@D-Au干预后犬尿喹啉酸和褪黑素显著上调。血清代谢组学显示亚油酸代谢通路显著改变，磷脂酰胆碱和亚油酸水平显著升高。
**2.9 F@D-Au改善SD大鼠饮食诱导的MASH及并发认知障碍**：采用CDHFD喂养SD大鼠16周建立MASH模型，口服治疗8周。肝脏超声显示F@D-Au显著改善脂肪肝状况。H&E、Masson三色、Sirius Red和Oil Red O染色显示F@D-Au显著减轻肝脏脂肪变性、坏死性炎症、气球样变和纤维化，与C57小鼠模型结果一致。Morris水迷宫显示F@D-Au治疗8周后大鼠找到平台时间显著缩短，测试期跨平台次数、平台象限停留时间和入台潜伏期显著改善。结果表明F@D-Au在C57BL/6小鼠和SD大鼠MASH模型中均展现显著治疗效应，提示其广泛适用性和临床转化潜力。
**2.10 F@D-Au设计与治疗机制示意图**：研究人员构建示意图说明手性金纳米酶工程化F. duncaniae的制备及其对MASH和相关认知障碍的治疗机制。口服F@L-Au/F@D-Au靶向肠-肝轴，纳米酶组分发挥CAT和SOD模拟活性清除胃肠道ROS，保护细菌抵抗恶劣胃肠道条件。F@L-Au/F@D-Au减轻肠上皮氧化损伤、恢复肠道屏障完整性、降低门静脉LPS浓度、减轻病理性肠-肝轴信号并改善肝脏脂肪变性、炎症和纤维化。F@D-Au干预重塑肠道菌群稳态、恢复Firmicutes/Bacteroidota平衡、调节微生物色氨酸和亚油酸代谢、减少肝脏、海马和血清中促炎介质，共同改善MASH及其相关认知障碍。
**讨论与结论**
讨论部分指出，单独使用纳米药物或益生菌均不足以应对MASH，因为益生菌易被胃肠液降解而失活。人工酶模拟机体天然抗氧化防御系统，通过清除ROS减轻炎症，为传统抗炎药物提供了潜在替代方案。本研究开发的F@D-Au通过将手性金纳米酶锚定于F. duncaniae表面，实现了纳米催化免疫治疗。得益于纳米酶的保护特性，益生菌能够耐受胃肠液损伤、成功定植于肠道并维持长时间滞留。在MASH小鼠模型中，F@D-Au比F@L-Au更有效地减缓MASH进展，显著改善肠道屏障完整性，减轻肝脏脂肪变性、坏死性炎症、气球样变和纤维化等标志性特征，改善肝脏和循环脂质参数，降低肝损伤生物标志物。肠道微生物组分析显示F@D-Au增加Bacteroidota比例、降低Firmicutes，使菌群结构接近健康对照。代谢组学分析揭示F@D-Au治疗后粪便色氨酸和血清亚油酸相关代谢谱改变，粪便犬尿喹啉酸和褪黑素升高，血清磷脂酰胆碱和亚油酸升高，这些代谢变化与MASH相关肝脏表型改善及认知障碍改善相关。血清亚油酸变化还与血清胆固醇降低和血糖调节相关。总之，微生物纳米药物为治疗MASH提供了有前景的方法，与传统药物疗法相比具有级联持续催化活性和增强生物安全性等显著优势。研究结论部分指出，本研究通过整合调控肠-肝轴展示了新型手性工程化益生菌平台（F@D-Au）治疗MASH的治疗潜力，结果表明了一种同时靶向肝脏和认知并发症的有前景的整合策略，值得进一步在临床试验中评估。局限性部分指出，本研究未进行密度泛函理论模拟或高分辨率表面表征以阐明D-Au更高催化活性背后的确定性原子级立体化学机制；16S rRNA测序和非靶向代谢组学分析仅对对照组、MASH组和F@D-Au组进行，未对单独F组和游离D-Au组进行平行多组学分析，当前组学数据无法完全区分益生菌菌株和纳米酶组分的独立分子贡献。
