《BioMed Research International》：Profile of Genes Encoding Antimicrobial Resistance and Virulence in 3963 Escherichia coli Isolates
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抗菌药物耐药基因（ARGs）与毒力相关基因（VAGs）在细菌病原体中的流行与传播构成重大公共卫生负担。大肠杆菌（Escherichia coli）作为一种机会致病菌，因其对人用和兽用抗生素耐药性的出现与扩散而备受关注。本研究旨在对2006年至2025年间NCB
抗菌药物耐药基因（ARGs）与毒力相关基因（VAGs）在细菌病原体中的流行与传播构成重大公共卫生负担。大肠杆菌（Escherichia coli）作为一种机会致病菌，因其对人用和兽用抗生素耐药性的出现与扩散而备受关注。本研究旨在对2006年至2025年间NCBI发布的完整水平组装的大肠杆菌基因组（n=3963）中ARGs与VAGs进行特征分析。从大肠杆菌分离株基因组中共鉴定出293种不同的ARGs和351种不同的VAGs。在293种ARGs中，41种存在于2006年提交的大肠杆菌菌株基因组中，其余252种ARGs在后续年份提交的基因组中被鉴定。基因组中富集了对应于氟喹诺酮类、青霉烷类、四环素类、头孢菌素类和大环内酯类药物的ARGs。分析表明，2037株（51.4%）分离株中ARGs至少占基因组的1.29%，1987株（50.13%）分离株中毒力基因至少占基因组的1.35%。对不同ARGs的分析显示，123种仅存在于质粒上，141种在染色体和质粒间共享，而VAGs则表现出更强的染色体定位倾向。crp和cpxA的单拷贝出现普遍存在于全部3963株分离株中，而sul1、tet(A)和blaTEM-1的多拷贝变体（≥2拷贝）在约5%的分离株中被检测到。序列分型分析显示，ST10在较高水平ARG Group III和IV中是最常见的序列型，而ST11和ST73中几乎所有菌株均携带较高水平的Group IV毒力基因。加权线性回归表明，大肠杆菌中编码ARGs的基因组比例每年增加0.00292个百分点。研究结果提示需要持续的基因组监测以应对AMR，并开发替代方法来克服AMR和毒力负担。
研究背景方面，抗菌药物耐药（AMR）是重大公共卫生问题，威胁抗生素有效性并显著增加细菌感染的发病率和死亡率。世界卫生组织（WHO）强调AMR威胁日益增多感染的有效预防和治疗。据预测统计模型报道，2019年细菌AMR相关死亡达495万例，其中约127万例归因于细菌AMR，AMR相关死亡率高于HIV-AIDS或疟疾。大肠杆菌是临床重要细菌，是尿路、血流和胃肠道感染的常见病因，也是全球死亡率增加相关的六大主要病原体之一，耐药菌株可进一步减少治疗选择。测序技术的进步使公共数据库中细菌基因组大量可用，为研究AMR的基因组基础和分布提供了宝贵资源。细菌可通过多种机制产生耐药性，包括限制药物摄取、修饰药物靶点、灭活药物和促进主动药物外排。可移动遗传元件通过不同机制促进ARGs传播，质粒是可独立复制的DNA分子，可携带多个ARGs，而转座子和插入序列可在DNA分子内或间动员遗传区域，整合子可捕获和组织基因盒包括耐药决定簇。然而，不同大肠杆菌菌株中染色体和质粒上ARGs和VAGs的存在尚未在纵向时间框架内进行研究，各种大肠杆菌分离株中ARGs和VAGs的基因组构成仍研究不足。因此研究人员开展了此项研究，旨在对2006年至2025年间提交至NCBI且符合研究纳入和排除标准的大肠杆菌分离株基因组中ARGs和VAGs进行特征分析。研究结论具有重要意义：共鉴定出293种不同ARGs和351种不同VAGs，51.4%分离株中ARGs至少占基因组1.29%，50.13%分离株中毒力基因至少占基因组1.35%；ARGs从质粒到染色体的交换可能增加AMR菌株的传播；ST分析显示ST10在较高水平ARG Group III和IV中最常见，ST11和ST73中几乎所有菌株携带Group IV毒力基因；加权线性回归趋势分析显示大肠杆菌中编码ARGs的基因组每年增加0.00292个百分点，而VAGs的轻微下降不显著。全基因组分析有潜力增强对AMR的理解，并有助于改善对抗感染性疾病的策略。针对常见抗菌药物耐药的基因阵列提示需要新策略来对抗AMR。
在技术方法方面，研究人员从NCBI基因组数据库检索大肠杆菌全基因组数据，仅纳入完整组装状态的基因组，要求CheckM完整性≥98%、污染<3%、NCBI ANI Check状态为"OK"。通过FastANI v1.34与参考大肠杆菌K-12亚株MG1655（GCF_000005845.2）比较平均核苷酸一致性（ANI），ANI<96.5%的基因组被排除。最终筛选3963个高质量大肠杆菌基因组。使用ABRicate v1.0.1工具结合CARD数据库（2025年1月14日更新，含2631条ARG序列）鉴定耐药基因，结合VFDB核苷酸数据库（2025年1月14日更新，含2597条VAGs）鉴定毒力基因。采用数据驱动的四分位数（Q1-Q4）分层方法对基因组进行ARG和VAG负担分组。使用MLST模块（v2.35.0）进行序列分型。采用Mann-Kendall检验评估单调时间趋势，Sen's斜率估计器量化变化速率，加权线性回归分析估计时间变化。所有统计分析使用RStudio（Version 4.3.1）完成。样本队列来源为NCBI基因组数据库2006年至2025年发布的完整组装大肠杆菌基因组。
研究结果方面，第一，基因组基本特征分析：3963株大肠杆菌基因组中位大小为5.17 Mb，范围4.45-6.25 Mb，中位G+C含量为50.65%（范围50.15%-51.06%），所有分离株与参考基因组ANI>96.5%，证实均为大肠杆菌。3393株分离株至少含一个质粒。第二，ARGs分析：CARD数据库筛选共鉴定193,713个ARGs命中，每基因组中位47个ARGs。2037株（51.4%）分离株编码ARGs至少占基因组1.29%。共鉴定293种不同ARGs，分属30个药物类别，其中141种同时存在于染色体和质粒，29种仅存在于染色体，123种仅存在于质粒。2006年提交的两株菌株UTI89和APEC 01含41种不同ARGs，后续年份提交的基因组中额外鉴定252种ARGs，其中23种仅见于2025年提交的基因组。ARGs数量最多的药物类别为头孢菌素（119种），其次为青霉烷类（94种）和氨基糖苷类（56种）。丰度最高的前五类药物类别为氟喹诺酮类、青霉烷类、四环素类、头孢菌素类和大环内酯类，所有基因组均含至少一种来自这五类的ARG。TEM-1是最普遍的ARG（1326/3963，33.5%），258个基因组含两个或以上拷贝，最多12拷贝。crp和cpxA单拷贝存在于全部3963株基因组中（100%流行率），近核心基因（>99%分离株）包括外排组件（acrA、acrB、tolC、mdfA和msbA）和全局调控因子（marA和H-NS）。17株菌株中≥1.75%基因组编码AMR决定簇，文献筛查显示其中7株（CRE1540、EC11、GD33、JNQH497、MRSN352231、NDM5和WCHEC025943）先前已被报道为抗菌药物耐药。第三，VAGs分析：VAGs中位比例为基因组的1.35%，1987株（50.13%）VAGs至少占基因组1.35%。共鉴定351种不同VAGs，其中102种同时存在于染色体和质粒，134种仅存在于染色体，115种仅存在于质粒。2006年提交的菌株含92种不同VAGs，后续年份额外鉴定259种。菌株EDL933含最多VAGs（122个），菌株DEC5E含最多不同VAGs（120个）。菌株TUM1886含20拷贝astA基因，为单VAG最高扩增。所有分离株中未发现共同存在的毒力基因集，表明毒力决定簇为附属基因集。第四，ARG-VAG在ST中的分布：MLST将3879个基因组分配到632个STs，84个基因组未能分配有效ST。最常见谱系为ST131（n=411），其次ST10（n=364）、ST11（n=275）、ST410（n=126）和ST167（n=112）。ST11（n=210）在ARG Group I中最常见，ST131（n=193）在Group II中占优，ST10在Group III（n=161）和IV（n=162）中均为最常见ST。ST10在VAG Group I（n=267）和II（n=71）中最常见，ST131（n=267）在Group III中最常见，ST11（n=274）在Group IV中富集，ST11（n=274/275）和ST73（n=57）几乎所有菌株携带Group IV毒力基因。第五，ARGs和VAGs的时间趋势分析：Mann-Kendall检验（τ=0.463，p=0.0048）和Sen's斜率（每年增加0.00433%，95% CI：0.00213-0.00716）支持ARGs基因组比例在2006-2025年间呈统计学显著增加，加权线性回归显示每年增加0.00292个百分点（95% CI：0.00075-0.00509；p=0.0111）。VAGs比例未检测到统计学显著时间趋势（Mann-Kendall τ=-0.189，p=0.2561；加权回归β=-0.00712，p=0.2493）。ARG-VAG合计比例亦无显著时间趋势（τ=-0.063，p=0.7212）。ARG与VAG合计中位比例为基因组的2.7%。
讨论部分总结：对3963株大肠杆菌基因组的综合分析鉴定出293种不同ARGs和351种不同VAGs，其在染色体和质粒上的分布各异，基因拷贝数差异显著，ARG和VAG基因组比例的时间模式不同。大肠杆菌分离株基因组大小范围4.45-6.25 Mb，可能归因于适应过程中基因和位点的获得与丢失。293种最佳命中ARGs赋予对30种不同类别抗生素的耐药性。2006年提交的大肠杆菌基因组含41种不同ARGs，一些ARGs古老且在抗生素使用成为标准实践后更为常见。AMR发展可由已有基因突变或通过水平基因转移获得ARGs所致。质粒在抗生素耐药性传播中起关键作用，123种质粒携带ARGs和141种染色体与质粒共享ARGs的鉴定表明质粒在AMR传播中的作用。115种质粒携带VAGs和102种共享VAGs进一步支持质粒在毒力中的作用。ARGs数量最多的靶向头孢菌素药物类别（119种），其次青霉烷类（94种）和氨基糖苷类（56种）。热图分析显示氟喹诺酮类、青霉烷类、四环素类、头孢菌素类和大环内酯类为ARGs数量最多的前五类药物类别。参数和非参数趋势分析显示含ARGs的大肠杆菌基因组百分比略有增加。尽管ARGs主要存在于质粒上，但编码毒素的基因主要与染色体相关。在17株菌株中，1.75%-1.95%的基因组编码ARGs，表明某些菌株中ARGs数量增加可能促成耐药机制。文献综述显示7株菌株先前已被报道为抗生素耐药。大肠杆菌的毒力潜力由多样的VAGs决定，促进定植、黏附、侵袭、营养获取、免疫逃逸和宿主内持续存在。本研究中VAGs的数量和多样性显著大于ARGs，表明其编码多种宿主相互作用和致病机制的基因组能力，强调在AMR之外考虑毒力决定簇的重要性。ST分析显示ST10在ARG Group III和IV中最常见，与先前报道超过71%的ST10分离株表现出多重耐药一致。ST11和ST73中几乎所有分离株携带Group IV毒力基因，先前研究也已将ST11和ST73鉴定为高毒力大肠杆菌谱系。加权线性回归分析进一步证明大肠杆菌基因组中编码ARGs的比例增加0.00292个百分点，这一时间增加可能反映ARGs的持续获得和维持，可能由水平基因转移 conferred 的适应性优势驱动。研究局限性包括：使用公共数据库基因组数据不代表社区分离株且可能过度代表医院暴发；仅分析公共数据库中完整基因组组装；许多分离株的地理来源、宿主来源、临床背景和抗生素暴露史等元数据不完整；分析未纳入基因表达谱、表型耐药测试或功能验证，因此数据突出的是毒力和抗生素耐药的遗传潜力而非实验证明的表型特征。研究结论翻译：本研究对3963株大肠杆菌基因组进行了ARGs和VAGs的综合分析，共鉴定出293种不同ARGs和351种不同VAGs。分析发现51.4%的分离株中ARGs至少占基因组1.29%，50.13%的分离株中毒力基因至少占基因组1.35%。ARGs从质粒到染色体的交换可能增加AMR菌株的传播。ST分析显示ST10在较高水平ARG Group III和IV菌株中均最常见，ST11和ST73中几乎所有菌株均携带Group IV毒力基因。加权线性回归趋势分析显示大肠杆菌中编码ARGs的基因组每年增加0.00292个百分点，而观察到的VAGs轻微下降不显著。全基因组分析有潜力增强对AMR的理解，并可能有助于改善对抗感染性疾病的策略。赋予对常见抗菌药物耐药的基因阵列提示需要新策略来对抗AMR。
