《Current Genetics》：Mitochondrial DNA control region of the endangered Busok cat (Felis catus) from Ra’as Island, Indonesia
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家猫起源于近东地区，并沿着人类贸易路线扩散，其线粒体控制区（mitochondrial control region）被用于追溯这一传播过程。岛屿种群具有重要研究价值，因为每一次奠基事件都只从源基因库中采样了部分遗传组成。然而，迄今仅有少数岛屿种群接受了遗传学
家猫起源于近东地区，并沿着人类贸易路线扩散，其线粒体控制区（mitochondrial control region）被用于追溯这一传播过程。岛屿种群具有重要研究价值，因为每一次奠基事件都只从源基因库中采样了部分遗传组成。然而，迄今仅有少数岛屿种群接受了遗传学评估。布索克猫（Busok cat）是一种来自印度尼西亚拉阿斯岛（Ra’as Island）的蓝灰色短尾地方品种，于2022年获得认定并制定了表型品种标准。该品种现已在该岛以外进行交易，但已知表型纯合的个体不足100只，且此前没有任何遗传数据可供参考。研究人员对三只布索克猫和一只来自西爪哇的非布索克蓝灰色猫的线粒体控制区进行了测序，分析了349 bp的双链片段，并将其与来自六个国家的66条参考序列、A–L单倍型（mitotype）标准面板以及两种野生猫科动物外群进行了比较。三只布索克猫携带两种母系单倍型——单倍型A（mitotype A）和单倍型B（mitotype B），这两种单倍型在全球家猫中均十分常见。西爪哇猫携带单倍型B，并与其中一只布索克猫的序列完全一致。在三只猫中检测到两个不同的谱系，表明至少有两个奠基雌性祖先，但由于样本量过小，无法准确评估单倍型多样性。这两个谱系均归属于广泛的世界性簇群。数据表明，布索克猫缺乏独特的母系谱系，这与人类辅助扩散所导致的全球基因库混合模式相符。该研究首次提供了该品种的母系DNA参考数据，核基因组标记和表型标记有望进一步阐明其起源。
一、研究背景与科学问题
家猫（Felis catus）起源于近东地区的非洲野猫（Felis silvestris lybica），约一万年前在肥沃新月地带与人类建立共生关系，随后沿陆地和海上贸易路线向全球扩散。线粒体DNA控制区（mitochondrial DNA control region, mtDNA CR）因其母系遗传、进化速率快等特点，已成为追踪家猫母系祖先和种群结构的标准化分子标记。国际法医数据库基于一段402 bp非重复区域，将全球家猫划分为A–L共12个主要单倍型（mitotype），覆盖约83%的个体。然而，现有研究对岛屿种群的遗传评估仍然匮乏。岛屿种群每次奠基事件仅从源基因库中捕获部分遗传变异，其母系谱系的存续既能反映奠基者的祖先构成，也能揭示后期人为引入的影响。
布索克猫（Busok cat）又称拉阿斯猫或马都拉猫，是原产于印度尼西亚东爪哇马都拉海峡拉阿斯岛的一种稀有家猫地方品种。该品种具有致密的蓝灰色被毛（“Busok”色）、柠檬形至椭圆形非蓝色眼睛，最显著的特征是短尾，尾部常呈尖端卷曲状，繁育者将其分为无尾型（rumpy, 0 cm）、短尾型（stumpy）和较长型（longy）。世界猫联合会（World Cat Federation, WCF）于2022年11月正式认可该品种，印度尼西亚布索克拉阿斯协会（Indonesian Busok Ra’as Association, IBRA）随即成立以协调繁育和保护工作。尽管该品种目前已具备相当的经济价值，但其数量极为稀少，已知表型纯合的个体不足100只，注册猫舍寥寥无几。更为关键的是，此前没有任何关于布索克猫的遗传数据发表。因此，该品种仅依据明确的拉阿斯产地、书面的表型标准和登记名录来界定，其遗传背景和起源完全未知。
鉴于上述空白，本研究旨在：（i）首次测定布索克猫的mtDNA控制区序列；（ii）将该品种的母系谱系置于全球家猫单倍型框架下进行定位；（iii）评估其母系遗传多样性并与参考群体进行比较；（iv）检验控制区能否区分布索克猫与其他家猫。这些问题的解答对于该稀有品种的保护、登记管理以及起源假说的验证具有基础性意义。
二、主要关键技术方法
研究人员采集了三只在西爪哇茂物动物科学中心（Animalium Animal Science Center, Bogor, West Java）圈养的成年布索克猫以及一只来自勿加泗（Bekasi, West Java）的非布索克蓝灰色（马尔济斯型）对照猫的外周血样本。采用DNeasy试剂盒提取基因组DNA，利用引物JHmtF3/JHmtR3扩增位于异质性RS2/RS3串联重复阵列之间的非重复性猫控制区片段（约490 bp），对双链产物进行Sanger测序以保证准确性。通过Biopython v1.87进行碱基判读和质量评分，经Mott算法末端修剪后生成每条个体的双链共有序列，仅纳入四只猫均在双链上达到Q≥20的连续重叠区域（最终分析长度为349 bp）。四条共有序列已提交至GenBank（登录号LC901156–LC901159）。参考序列选自已发表的涵盖JHmtF3/JHmtR3扩增片段的控制区数据集，包括13个全球参考单倍型（A–L及D5）以及来自加拿大、德国、波兰、瑞典、泰国和土耳其的66条家猫序列，另以两只野生猫科动物（Felis silvestris lybica和Herpailurus yaguarondi）作为外群。所有72条序列经MAFFT v7.526比对后修剪至349 bp高置信度区域。单倍型多样性（haplotype diversity, Hd）和核苷酸多样性（nucleotide diversity, π）使用pegas v1.4在R v4.4.2中计算。最大似然树（maximum likelihood, ML）由IQ-TREE v3.1.1基于ModelFinder选定的替代模型（TPM2u+I）构建，节点支持率通过1000次超快自举（ultrafast bootstrap）和SH-aLRT检验评估。此外，还构建了邻接树（neighbor-joining tree, TN93距离, 1000次自举）和中位连接网络（median-joining network）以直观展示母系亲缘关系。
三、研究结果
3.1 序列质量
双向测序每只个体获得495–497 bp的共有序列，其中383–388 bp在双链上得到确认。四份样本中有三份的双链重叠区未发现碱基分歧；唯一一处低质量末端的微小分歧（布索克猫1号）经质检确认位于分析区域之外。所有诊断性替换均位于高置信度区域内。
3.2 布索克猫中存在两种母系单倍型
在全部72条序列可比对的349 bp区域内，四个变异位点区分出四只猫中的两种母系单倍型。两只布索克猫共享一种单倍型（HapA），第三只布索克猫与勿加泗猫共享第二种单倍型（HapB）。
3.3 布索克猫谱系属于两种最常见的全球单倍型
两种布索克猫单倍型在349 bp范围内与全球参考单倍型完全一致（100%）：两只猫的谱系对应单倍型A（mitotype A, EU864495），一只猫/勿加泗猫的谱系对应单倍型B（mitotype B, EU864496），两者均为全球家猫中最常见的母系单倍型。勿加泗猫作为普通非布索克马尔济斯型家猫，携带与其中一只布索克猫相同的母系单倍型，且在分析区域内无法区分。因此，mtDNA控制区本身无法认证一只猫是否为布索克猫，这对登记和保护实践具有直接影响。
3.4 母系多样性与样本量效应
在70只家猫的分析中，349 bp区域包含23个分离位点和26个单倍型（π=0.0106）。三只布索克猫的单倍型多样性为0.67（π=0.0076），而参考群体的Hd范围为0.82至1.00。但稀化分析（rarefaction）显示，在所有三只猫的子样本中，泰国群体有45.1%、土耳其群体有14.7%、波兰群体有7.1%的子样本Hd等于或低于0.67，而瑞典群体无一例如此。布索克猫的Hd值落在参考群体三只子样本的范围之内，尤其是接近泰国群体的情况，并不指示多样性降低。无论样本量如何，两个分歧谱系的存在证实了至少有两个奠基雌性祖先。
3.5 布索克猫谱系嵌套于世界性母系簇群之中
在中位连接网络中，两个频率最高的中央节点恰好由布索克猫单倍型占据，并且这些单倍型也与来自泰国、波兰、瑞典、土耳其及其他全球参考的猫共享。最大似然树和邻接树均显示，布索克猫聚集在由相同或近乎相同的世界性单倍型构成的大型簇群内，其内部枝长极短且支持率较低，反映了全球分散家猫之间控制区变异的有限性，而非独特的岛屿谱系。平均配对距离（TN93）显示，单倍型A谱系最接近泰国群体（0.0077），单倍型B谱系最接近瑞典群体（0.0045），但这些距离反映的是各参考群体中单倍型的频率分布，而非实际地理起源。
四、讨论与结论
讨论部分指出，尽管样本量有限，但三个关键发现是可靠的：该品种至少拥有两条母系谱系；这两条谱系对应全球最普遍的家猫单倍型A和B；在该分子标记水平上，布索克猫无法与普通家猫区分。布索克猫携带单倍型A和B，最简洁的解释是人类介导的家猫从单一近东起源地向外扩散的历史过程。近期一项针对五个泰国品种的多标记研究发现同样的A和B单倍型在所有泰国品种和全球范围内共享，但布索克猫与泰国猫之间表观上的母系联系不应被解读为共同祖先的证据，因为单倍型A和B在各群体中均十分常见。最近群体距离也未能改变这一观点，因为它们测量的是每种单倍型在各参考群体中出现的频率，而非地理位置。布索克猫与泰国科拉特猫（Korat, Si-Sawat）的表型相似性引人关注，但共同的亚洲起源需要通过核基因性状分型和更广泛的采样来检验。
三只猫中存在两个不同母系谱系表明它们至少来源于两个原始雌性祖先。与日本对马群岛（Tsushima Islands）50只猫展现出的十个控制区单倍型相比，由于样本量过小，无法判断拉阿斯岛是否类似于对马群岛的情况。目前布索克猫是一个随机交配群体，数据并未指示其拥有独立的基因库，在母系方面它似乎是更大范围东南亚家猫种群的一部分。尽管如此，考虑到表型纯合个体不足100只，建议实施遗传管理以防止未来出现瓶颈效应。
局限性方面，样本量小且为异地采集，无法得出群体层面的结论，多样性估计不可靠。控制区仅代表单个母系遗传位点，不提供父系贡献、杂交或品种特异性核性状的信息。全线粒体基因组测序有望提供更高的变异分辨率。下一步计划对四个存档样本进行线粒体全基因组测序。
由于普通家猫与布索克猫共享母系单倍型，控制区无法确认品种身份，验证品种身份需要尚未检测的核基因座。具体而言，短尾性状应检测HES7基因c.5T>C突变（与亚洲卷尾表型相关）以及T-box（brachyury）基因（含西方起源的马恩岛猫变异），部分短尾亚洲猫缺乏这些变异，因此还需额外位点；蓝灰色被毛由MLPH基因的单碱基缺失导致；巧克力色被毛源于隐性TYRP1等位基因；而TYR G302R等位基因（导致重点色图案）已被品种标准排除。对于个体鉴定和亲子关系，核微卫星标记优于mtDNA。
关于布索克猫起源的假设——暹罗国王拉玛五世可能曾将猫赠予爪哇和马都拉精英阶层——本研究数据无法检验。单倍型A和B的存在既可能与源自泰国猫相一致，也可能早于或晚于马都拉人在拉阿斯岛的定居，或是近期人为引入的结果。稀释蓝灰色被毛在印度尼西亚其他地区家猫中并不常见，符合引入表型的特征，但无法确定其来源。区分这些场景需要对核标记进行分析、直接从拉阿斯岛采样，并与泰国及区域群体进行比较。
研究结论翻译：研究人员报告了濒危布索克猫的首批线粒体DNA特征。该品种携带两种母系谱系——单倍型A和B，它们是全球家猫中最常见的单倍型之一，并且在此分子标记水平上，布索克猫无法与普通家猫区分。这些经过验证的序列为该拉阿斯岛地方品种提供了首个母系基线数据。它们未显示出特定的母系谱系，也未确认或排除任何特定的地理起源。为验证品种身份并确定其起源，核标记和表型标记将是必要的，同时还需直接从拉阿斯岛进行采样。
