空间扩展Flow Phixer（SpeF-Phixer）：基于空间扩展?混合框架在重构基因场中发现空间调控基序

《Journal of Pathology Informatics》：Spatially extended Flow Phixer (SpeF-Phixer): A spatially extended ?-mixing framework for spatial regulatory motif discovery in reconstructed gene fields

　　

背景与目的：空间转录组学为研究组织结构和基因调控提供了丰富的空间背景信息。然而，能够从常规组织学图像中提取类似空间调控信息的方法仍然有限。研究人员开发了空间扩展Flow Phixer（SpeF-Phixer），这是一个空间扩展的?（phi）混合框架，整合全切片图像（WSI）衍生的空间细胞分布与映射的单细胞RNA测序（scRNA-seq）表达场，以识别空间组织化的方向依赖性基序。方法：使用CD103/CD8免疫染色的结直肠癌WSI和公开可获得的scRNA-seq数据集，在映射细胞周围构建空间基因场并进行离散化，用于带符号的?混合计算。通过基于k近邻的邻域筛选和bootstrap共识推断评估成对依赖性、方向符号和三联体结构。使用广义相加模型区分中介与收敛。进一步通过真实-零比较和数据库支持的方向分析表征空间组织和方向一致性。结果：跨组织斑块，该流程将约36,000个三联体候选缩减为每个斑块约300个稳定共识三联体。从Y到Z的下游边显示出与 curated 调控数据库一致的方向偏倚。空间路径追踪显示，推断三联体的连贯性显著高于零对照，表明所识别的基序呈现非随机空间组织。结论：SpeF-Phixer能够从组织学图像中识别空间连贯且方向一致的三基因调控基序。该框架将单细胞分子谱与组织结构联系起来，为空间调控基序发现和空间信息调控网络的探索性重构提供了可扩展的基础。

研究背景与问题

基因调控网络（GRN）推断是系统生物学的核心任务，但长期面临挑战。经典方法包括基于相关性的聚类、回归与树集成预测、贝叶斯与动态贝叶斯网络，以及信息论方法如ARACNE、CLR、MRNET和PIDC，均从 bulk 或单细胞RNA表达谱估计成对关系。这些方法统计假设与计算需求各异，但共享关键局限：多数仅作用于表达矩阵，无法区分直接与间接互作、因果方向性，或由组织结构与细胞邻近性决定的背景特异性调控程序。Phixer的独特之处在于使用?混合系数——一种方向性、非对称的依赖性度量，自然编码X_i→X_j与X_j→X_i的区别，并允许循环，与生物调控特性相符；其还采用类似数据处理不等式的三联体剪枝规则抑制级联假阳性。然而?混合推断仍受限于将每个细胞视为孤立表达向量，忽略真实组织中塑造基因-基因依赖性的空间组织与表型异质性。空间转录组反卷积方法（如CIBERSORTx、SPOTlight、RCTD/Spacexr、Cell2location、Tangram）虽体现组织学背景整合的价值，但解决的是组织组成而非因果基因关系；深度学习细胞分类模型虽能准确识别WSI中的细胞类型，却未与GRN推断系统整合。因此现有GRN方法缺乏纳入细胞位置、周围表型及局部微环境如何调节分子互作的机制。

研究开展与意义

为此，研究人员提出SpeF-Phixer，作为原始Phixer算法的空间感知扩展，纳入：（i）通过AI细胞检测与分类获得的高分辨率组织结构；（ii）映射到组织学坐标的空间分层单细胞表达谱。该方法不单纯从bulk或scRNA-seq分布推断边，而是结合?混合不对称性与组织分辨的共定位、邻域组成和细胞-细胞互作模式，估计三联体水平的方向结构X→Y→Z。这种空间增强可解决仅表达推断固有的模糊性，尤其对非空间GRN模型中拓扑不可区分的三联体构型。研究利用AI引导的WSI细胞表型分析与scRNA-seq谱映射，构建空间锚定的方向?混合矩阵并在局部微环境间共识估计，识别常规表达网络分析未捕获的稳定空间调控三联体，桥接数字病理与空间调控基序发现，有助于探索肿瘤-免疫界面、基质生态位及组织驻留记忆T细胞（Trm）富集微环境中的调控基序。

关键技术方法

研究纳入303例结直肠癌患者活检或手术标本（含或不含新辅助放化疗），FFPE后行CD103/CD8双免疫染色。采用Cu-Cyto? Viewer进行人-AI协同标注，以专家标注坐标为中心提取40×40像素细胞斑块，每类采样阈值11,000，训练ResNet与定制ViT进行细胞类型分类。scRNA-seq采用GEO数据集GSE132465（10× Genomics，含作者提供的细胞注释与表达矩阵）。基因面板由CV筛选的前1000个高变基因（HVG）与验证谱系标志物合并构成（约1500–2000个基因，数据集依赖）。以分位数阈值规则识别细胞类型。核心流程构建空间基因场并离散化，进行带符号?混合计算、k近邻邻域筛选、bootstrap共识推断，并以广义相加模型区分中介与收敛，结合真实-零比较与数据库方向分析验证。

研究结果

跨组织斑块的三联体共识收敛：通过k近邻邻域筛选与bootstrap共识推断，流程将每个斑块约36,000个三联体候选缩减为约300个稳定共识三联体，表明空间分层与共识策略可有效压缩候选空间并保留稳定结构。

下游边的方向偏倚与数据库一致性：对推断三联体中Y→Z下游边的方向符号分析显示显著方向偏倚，且与 curated 调控数据库支持的方向一致，提示推断的方向性具有外部可参照性。

空间路径追踪的连贯性：真实-零比较显示，推断三联体的空间路径连贯性显著高于零对照，说明所识别基序呈现非随机空间组织，而非仅由表达分布偶然产生。

中介与收敛的区分：借助广义相加模型对三联体进行中介/收敛判别，并对代表性三联体进行空间叠加可视化（以红、绿、蓝分别编码X、Y、Z表达，箭头颜色表示推断方向），展示了两类调控三联体的空间流场特征。

讨论与结论

研究将组织学图像衍生的细胞空间分布与scRNA-seq表达场结合，使?混合推断从孤立表达向量扩展到空间分层框架，从而在保留方向性与循环允许特性的同时引入组织背景。方法学上，空间邻域筛选与bootstrap共识提升了三联体选择的稳健性，真实-零比较与数据库方向分析提供了空间组织与方向一致性的双重佐证。该框架的适用性以结直肠癌CD103/CD8染色WSI与公开scRNA-seq为验证场景，其上游表达重构步骤不属于SpeF-Phixer核心，直接测量的空间转录组表达与坐标可绕过该重构直接输入。研究结论为：SpeF-Phixer能够从组织学图像中识别空间连贯且方向一致的三基因调控基序；该框架将单细胞分子谱与组织结构相联系，为空间调控基序发现及空间信息调控网络的探索性重构提供了可扩展基础。