《Journal of Pharmaceutical Analysis》：Wogonin suppresses colorectal carcinogenesis by dually targeting the gut microbiota and host PLCγ1-dependent signaling
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结直肠癌（CRC）的全球疾病负担凸显了靶向宿主-微环境复杂相互作用的创新干预策略的迫切需求。天然黄酮类化合物汉黄芩素（Wog）作为一种有前景的候选药物，但其在CRC中的作用机制尚不明确。本研究利用慢性结肠炎和结肠炎相关癌症小鼠模型，证明Wog可改善肠道炎症和肿
结直肠癌（CRC）的全球疾病负担凸显了靶向宿主-微环境复杂相互作用的创新干预策略的迫切需求。天然黄酮类化合物汉黄芩素（Wog）作为一种有前景的候选药物，但其在CRC中的作用机制尚不明确。本研究利用慢性结肠炎和结肠炎相关癌症小鼠模型，证明Wog可改善肠道炎症和肿瘤发生。多组学分析揭示，Wog同时重塑肠道菌群并显著降低粪便中二酰甘油（DAG）——一种致癌性脂质第二信使——的水平。重要的是，Wog在菌群耗竭小鼠中仍然有效，并持续降低肠道DAG水平，表明存在直接的宿主靶向机制。进一步研究确定磷脂酶Cγ1（PLCγ1）为关键介质，Wog直接结合PLCγ1的Arg116位点，从而抑制其磷酸化及随后的宿主源性DAG产生。该相互作用最终抑制蛋白激酶Cα（PKCα）/丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）/细胞外信号调节激酶（ERK）信号级联。PLCγ1敲低或Arg116突变后Wog疗效丧失，证实了该机制的重要性。研究结果确立Wog为一种双重作用剂，整合了菌群重塑与直接PLCγ1抑制，为CRC干预提供了新策略。
结直肠癌（CRC）是全球发病率和死亡率极高的恶性肿瘤之一，其肿瘤发生涉及复杂的分子改变，炎症性肿瘤微环境在连接遗传易感性与恶性进展中的作用日益受到重视。肠道菌群在维持肠道稳态中发挥关键作用，但菌群失调可通过诱导炎症、产生基因毒素和形成生物膜等机制促进CRC的发生发展。微生物代谢物是该过程中的关键介质，例如微生物来源的脱氧胆酸可抑制CD8?T细胞功能从而促进CRC进展。然而，肠道肿瘤发生并非仅由微生物驱动，宿主细胞（如上皮细胞和免疫细胞）对致癌刺激和代谢物的内在反应同样至关重要。因此，理想的治疗策略应同时靶向微生物生态并增强宿主内在防御机制。天然产物是抗癌药物发现的重要资源，汉黄芩素（Wog）是从黄芩属植物中分离的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗病毒等多种生物活性，并在癌症治疗中显示出临床前疗效。目前关于Wog在CRC中抗癌作用的研究主要集中在其宿主细胞内在作用方面，包括抗炎、抑制增殖和诱导凋亡，但Wog的抗肿瘤活性在多大程度上依赖肠道菌群调控尚未被严格评估，菌群依赖性与宿主内在机制之间的潜在协同作用也知之甚少。基于此，研究人员开展了本研究。
研究人员利用慢性结肠炎和结肠炎相关癌症小鼠模型，结合多组学分析、菌群耗竭实验、细胞实验和分子互作实验，系统阐明了Wog抑制CRC的双重机制。研究结论为：Wog通过重塑肠道菌群以减少致癌性DAG，从而破坏DAG/PKCα/MAPK轴；同时通过直接靶向宿主PLCγ1抑制其酶活性及下游信号传导，发挥抗肿瘤作用。研究揭示了新的"微生物-代谢物-宿主"调控轴，并将PLCγ1确立为Wog的直接靶点，为其进一步治疗开发奠定了机制基础。该论文发表在《Journal of Pharmaceutical Analysis》。
在技术方法方面，研究人员主要采用了以下关键技术：AOM/DSS诱导的结直肠癌小鼠模型及慢性DSS结肠炎模型（C57BL/6小鼠，6–8周龄，雄性）；抗生素鸡尾酒（ABX）菌群耗竭模型；宏基因组测序（PacBio Sequel平台SMRT长读长测序）；伪靶向脂质组学分析（LC-MS）；RNA测序（RNA-seq）分析；以及多种分子互作检测技术包括分子对接、细胞热位移 assay（CETSA）、药物亲和响应靶稳定性 assay（DARTS）和微量热泳动（MST）。此外还使用了PLCγ1敲低（shRNA）和Arg116突变体过表达等基因操作手段。
研究结果如下：
3.1 Wog减轻小鼠慢性结肠炎相关恶性进展。在慢性DSS诱导结肠炎模型中，Wog低剂量（25 mg/kg）和高剂量（50 mg/kg）组均表现出结肠长度增加、结肠息肉减少，H&E染色显示上皮损伤和炎症浸润显著减轻，Ki-67阳性细胞显著减少。Wog显著降低TNF-α和IL-1β表达，恢复杯状细胞数量和黏液分泌，上调紧密连接蛋白（ZO-1、occludin、claudin-3）。低剂量与高剂量组疗效相当，提示可能存在天花板效应。
3.2 Wog抑制AOM/DSS处理小鼠的CRC。Wog显著降低肠道肿瘤发生率，尤其是直径大于3 mm的肿瘤，减少Ki-67阳性增殖细胞，抑制血清和结肠组织中TNF-α和IL-1β升高，逆转杯状细胞耗竭和黏液分泌减少，上调ZO-1和occludin表达。Wog治疗未显示明显毒性，血清ALT和AST水平稳定，主要器官未见组织病理学异常。
3.3 Wog通过缓解肠道菌群失调抑制CRC进展。宏基因组测序显示α多样性无显著差异，但β多样性分析显示三组间微生物群落组成存在显著差异。模型组中Parabacteroides丰度增加和Prevotellamassilia丰度降低被Wog显著逆转。LEfSe分析鉴定出Akkermansia muciniphila（A. muciniphila）及相关分类群在Wog治疗小鼠中显著富集。Wog增强了A. muciniphila对CRC细胞生长的抑制作用，而对正常肠道上皮细胞活力无一致影响。
3.4 Wog通过调节脂质代谢物抑制CRC。KEGG通路富集分析显示Wog调节的差异菌群功能显著富集于脂质代谢通路。伪靶向脂质组学分析显示模型组与Wog组粪便脂质谱明显分离，鉴定出59种显著下调代谢物和1种上调代谢物。筛选VIP>1的关键代谢物发现全部9种显著改变的代谢物均为DAG，丰度排名前三的为DAG（18:2/18:2）、DAG（18:1/18:2）和DAG（16:0/18:2）。Spearman相关分析显示DAG丰度与模型组富集菌属正相关，与Wog组富集菌属负相关，特定DAG种类与A. muciniphila呈显著负相关。
3.5 DAG对正常和恶性肠道上皮细胞发挥相反作用。在正常人类结肠上皮细胞系（NCM460和FHC）中，DAG暴露显著降低细胞活力并诱导凋亡，表现为TUNEL阳性信号增加、cleaved-caspase-3/caspase-3和Bax/Bcl-2比值升高。相反，DAG促进CRC细胞系（HCT116和HT29）的活力和增殖，并显著增强小鼠来源类器官（MDOs）的生长。DAG诱导PKCα从细胞质向质膜转位并增加激酶活性，激活CRC细胞中MEK/ERK信号级联。结果表明DAG是通过激活PKCα-MAPK信号轴促进结直肠癌发生的关键代谢调节因子。
3.6 菌群耗竭揭示Wog的直接宿主靶向作用。在AOM/DSS诱导CRC模型中，抗生素鸡尾酒（ABX）耗竭菌群后，Wog仍显著抑制肿瘤数量和大小，维持抗增殖效应，保护黏液屏障完整性，抑制血清和结肠组织中TNF-α、IL-1β和IL-6表达，增强肠道屏障（ZO-1、occludin和claudin-3上调）。ABX处理消除了Wog对粪便DAG的降低作用，但Wog在常规和菌群耗竭小鼠中均显著抑制结肠组织内DAG积累，并有效抑制PKCα、MEK和ERK磷酸化。结果表明Wog对宿主DAG-PKCα-MEK-ERK信号轴的直接抑制是不依赖菌群的主要保护机制。
3.7 Wog靶向PLCγ1抑制异常DAG-PKCα/MAPK信号。RNA-seq显示Wog同时抑制DAG合成关键酶Plcg1表达并上调多种DAG降解酶（Dgkh、Dgki、Dgkg、Dgkb）。qPCR证实Wog显著下调Plcg1。Wog显著降低结肠组织中PLCγ1表达，且在常规和菌群耗竭小鼠中均持续存在。Wog直接抑制PLCγ1基础表达和活化（Tyr783磷酸化），不依赖肠道菌群。在CRC细胞中，Wog显著抑制PLCγ1表达和磷酸化，降低DAG水平，减少PKCα及下游MEK和ERK磷酸化。外源性DAG补充有效逆转Wog诱导的CRC细胞活力、克隆形成和EdU掺入抑制，并恢复PKCα/MEK/ERK磷酸化。结果表明Wog主要通过靶向PLCγ1/DAG/PKCα/MAPK信号轴抑制CRC细胞生长。
3.8 PLCγ1对Wog抗肿瘤功效至关重要。在HCT116和HT29细胞中进行PLCγ1敲低后，Wog对细胞活力、克隆形成能力和EdU掺入的抑制作用显著减弱。分子水平上，PLCγ1敲低消除了Wog诱导的PLCγ1表达和磷酸化降低、细胞内DAG耗竭及PKCα/MEK/ERK磷酸化抑制。结果确立PLCγ1为Wog抑制DAG-PKCα-MEK-ERK信号轴的关键细胞靶点。
3.9 Wog直接结合PLCγ1的Arg116位点。CETSA结果显示Wog处理增强PLCγ1热稳定性（47.5–52.5 °C范围内蛋白保留增加），DARTS实验显示Wog增强PLCγ1对链霉蛋白酶消化的抗性。分子对接预测Arg88、Asp89和Arg116为候选结合位点。MST实验验证野生型PLCγ1的结合亲和力KD为14.9 μM，Arg116突变完全破坏结合，而Arg88和Asp89突变体保持与野生型相当的亲和力（KD分别为16.8和15.2 μM）。在CRC细胞中过表达野生型PLCγ1或结合缺陷型突变体（OE-PLCγ1-Arg116A），Wog对野生型PLCγ1表达细胞的活力和增殖抑制效果显著，而在Arg116突变细胞中几乎消失。机制分析证实Wog介导的PLCγ1磷酸化抑制、细胞内DAG降低和下游PKCα/MEK/ERK抑制在Arg116突变细胞中被消除。此外，A. muciniphila条件培养基（A. muciniphila-CM）可抑制PLCγ1磷酸化并降低细胞内DAG积累，伴随下游PKCα/MEK/ERK磷酸化降低。结果表明Wog与PLCγ1 Arg116的直接相互作用是破坏致癌信号传导并介导其抗肿瘤功效的必要条件。
讨论部分总结：慢性肠道炎症是炎症性肠病（IBD）患者恶性进展的主要风险因素。Wog在慢性结肠炎和AOM/DSS诱导的癌变模型中已显示治疗潜力，但其分子机制尚未完全阐明。本研究揭示了Wog的双重机制：调节肠道菌群-代谢物-宿主信号轴，以及通过直接靶向宿主PLCγ1发挥不依赖菌群的作用。炎症免疫细胞及其相关细胞因子是CRC发生发展的公认介质，Wog在慢性结肠炎和肿瘤发生阶段一致抑制全身和局部结肠炎症细胞因子，且不受抗生素耗竭菌群影响。肠道稳态维持关键依赖功能性上皮屏障，Wog在整个疾病进展中保护黏液屏障和机械屏障。肠道黏液层是共生菌群的重要栖息地，Wog显著重塑肠道微生物组成，降低Parabacteroides相对丰度，显著增加Prevotellamassilia。LEfSe分析鉴定出Akkermansia在Wog治疗组显著富集，A. muciniphila对CRC细胞具有直接抗肿瘤活性并与Wog协同作用。粪便脂质组学分析鉴定出Wog治疗后多种DAG种类显著降低，DAG的致癌潜力主要归因于其激活PKC及下游信号效应器的能力。DAG对正常肠道上皮细胞诱导凋亡，而对已建立CRC细胞促进增殖，DAG处理诱导PKCα膜转位和磷酸化，随后激活MEK/ERK级联。通过ABX菌群耗竭实验证明，Wog在菌群耗竭条件下仍有效抑制肠道肿瘤形成、减轻炎症、增强屏障完整性，并进一步降低肠道组织DAG含量、抑制PKCα/MAPK信号活化。PLCγ1在AOM/DSS诱导CRC小鼠肠道组织中高表达且磷酸化水平显著升高，Wog不依赖菌群显著抑制这种过度活化。通过CETSA、DARTS、分子对接、MST和结合位点突变，确定Wog主要通过Arg116残基直接与PLCγ1相互作用，抑制其酶活性，减少DAG产生和下游促肿瘤信号。研究也承认若干局限性：未通过粪菌移植（FMT）或单菌定植实验进行体内直接验证；DAG水平使用全结肠组织匀浆测定，无法区分上皮与非上皮细胞贡献；DAG-PKC信号相互作用的背景依赖性机制探索超出本研究范围。研究结论翻译：总之，本研究阐明了Wog抑制结肠炎相关CRC进展的双重机制：首先通过重塑肠道菌群减少致癌性DAG，从而破坏DAG/PKCα/MAPK轴；其次通过直接靶向宿主PLCγ1抑制其酶活性及下游信号传导。这些发现揭示了新的"微生物-代谢物-宿主"调控轴，并将PLCγ1确立为Wog的直接靶点，为其进一步治疗开发奠定了机制基础。
