褐沙海参（Holothuria grisea）来源的岩藻糖基化硫酸软骨素（FucCS）在过敏性气道炎症模型中的治疗作用研究

《Inflammopharmacology》：Therapy with Fucosylated Chondroitin Sulfate Extracted from Holothuria grisea in Allergic Airway Inflammation Model

　　

摘要专业翻译 当前哮喘疗法受限于显著的不良反应，且许多重症哮喘患者仍无法实现充分的症状控制，这凸显了对新型治疗策略的需求。岩藻糖基化硫酸软骨素（Fucosylated Chondroitin Sulfate, FucCS），一种从海参Holothuria grisea中分离得到的糖胺聚糖（glycosaminoglycan, GAG），具有抗炎特性。本研究在卵清蛋白（ovalbumin, OVA）诱导的过敏性气道炎症小鼠模型中探讨了FucCS的治疗潜力。研究人员将C57BL/6小鼠经OVA致敏和激发后，分别腹腔注射FucCS（2 mg/kg）、地塞米松（dexamethasone, DEXA，2 mg/kg，阳性对照）或生理盐水（saline, SAL，溶媒对照）。另设对照组小鼠在致敏和激发阶段均接受生理盐水（CTRL/SAL）而非OVA。研究人员评估了肺功能、支气管周围炎症程度、支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）及肺组织中的总细胞数和分类细胞计数，以及关键炎症介质的水平。与OVA/SAL组相比，FucCS治疗显著降低了基础气道阻力、支气管周围炎症及肺实质中的多形核细胞浸润。此外，FucCS治疗减弱了BALF总细胞数和白细胞介素（interleukin, IL）-4水平，并降低了肺匀浆中的IL-5水平，其效果与地塞米松相当。两种治疗均未改变BALF中嗜酸性粒细胞的比例。这些发现表明，FucCS在实验性过敏性炎症中具有有限但显著的抗炎作用，支持其作为治疗候选药物的进一步开发。

论文解读

一、研究背景与目的

哮喘是一种异质性且高度流行的慢性呼吸系统疾病，以慢性气道炎症、支气管高反应性、黏液过度分泌和可变的气流受限为特征，并可能进展为肺部结构性重塑。尽管过去25年来，由于吸入性糖皮质激素（inhaled corticosteroids, ICS）的广泛使用，哮喘相关死亡率有所下降，但相当比例的重症患者即使在联合使用糖皮质激素和长效β2受体激动剂的强化治疗下仍控制不佳。此外，即使低剂量ICS也伴随局部不良反应，如咳嗽、口腔念珠菌病、发声困难和咽喉刺激，而长期或高剂量使用可导致全身性并发症，包括骨密度降低、感染风险增加、白内障、青光眼和下丘脑-垂体-肾上腺轴抑制。这些局限性凸显了开发能够减轻气道炎症同时最大限度降低治疗相关毒性的新型治疗方法的迫切需求。

在此背景下，岩藻糖基化硫酸软骨素（FucCS）——一种从海参Holothuria grisea中分离的糖胺聚糖——作为潜在候选分子受到关注。结构上，FucCS类似哺乳动物硫酸软骨素，由D-葡萄糖醛酸（GlcUA）和4、6位硫酸化的N-乙酰-D-半乳糖胺（GalNAc）重复二糖单元组成，其独特之处在于存在α-L-岩藻糖基（α-L-Fucp）二糖分支，即3-O-硫酸化α-L-Fucp（1→2）连接至α-L-Fucp，附着于β-D-葡萄糖醛酸残基的O-3位。这种独特的岩藻糖基化模式在哺乳动物内源性糖胺聚糖中不存在，被认为与其独特的生物学特性有关。值得注意的是，FucCS已被证明在体外能有效抑制P-和L-选择素，并在炎症模型中减弱体内中性粒细胞募集，如巯基乙酸盐诱导的腹膜炎症和脂多糖诱导的肺部炎症。基于这些观察，研究人员假设给予源自Holothuria grisea的FucCS可减轻过敏性气道炎症小鼠模型中的气道炎症并改善肺功能。

二、主要技术方法

本研究采用了多项关键技术方法。首先，研究人员从Holothuria grisea海参体壁中提取总多糖，采用简化的盐析法（salting-out）进行纯化，通过逐步氯化钠和乙醇浓度梯度洗涤获得高纯度FucCS。其次，利用琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）分析各洗脱级分的迁移特征，与FucCS标准品比对确认目标组分。第三，采用一维核磁共振（1D 1H NMR）波谱技术在800 MHz下对纯化产物进行结构表征，确认其岩藻糖分支特征峰。在体内实验方面，研究人员建立了卵清蛋白（OVA）诱导的过敏性气道炎症小鼠模型，使用雄性C57BL/6小鼠（6-7周龄），在第0天和第14天腹腔注射OVA和氢氧化铝佐剂进行致敏，随后在第15-18天和第21-23天通过鼻内滴注OVA进行激发。治疗组分别腹腔注射FucCS（2 mg/kg，每次激发后1小时）、地塞米松（2 mg/kg，隔次激发后）或生理盐水。肺功能评估采用全身体积描记法（whole-body plethysmography）测量气道阻力和动态顺应性。组织学分析包括苏木精-伊红（HE）染色评估支气管周围炎症指数和肺实质炎症细胞浸润。炎症介质检测采用酶联免疫吸附测定（ELISA）定量肺匀浆和BALF中的IL-4和IL-5水平。BALF总细胞数和分类细胞计数分别通过Neubauer计数板和Diff Quik染色后显微镜下计数完成。

三、研究结果

FucCS的提取与纯化

研究人员通过顺序乙醇沉淀法从Holothuria grisea海参体壁中提取糖胺聚糖，琼脂糖凝胶电泳显示不同级分的迁移特征各异。与参考标准品（预纯化FucCS和Fucan）相比，2×2 M和3×2 M级分与FucCS迁移相似，而1×3 M级分与Fucan一致。其中3×2 M级分纯度最高，被选用于NMR结构表征和后续体内实验。NMR波谱确认了FucCS的预期结构特征，包括β-葡萄糖醛酸的H3和H2信号、CH?-GalNAc和CH?-Fuc峰，以及异头区的四个特征信号：A1和C1分别对应α-岩藻糖2,4-二硫酸化和α-岩藻糖3,4-二硫酸化的异头质子，E1和F1分别对应非还原端和还原端的非硫酸化α-岩藻糖和3-硫酸化α-岩藻糖。

FucCS和地塞米松改善肺力学

在OVA诱导的过敏性气道炎症小鼠模型中，与CTRL/SAL组相比，OVA/SAL组气道阻力增加了78.6%（p<0.0001）。FucCS和地塞米松治疗分别使气道阻力较OVA/SAL组降低20.2%（p=0.01）和25.4%（p=0.0013）。然而，该模型未观察到对乙酰甲胆碱的气道高反应性。

FucCS和地塞米松减轻支气管周围和实质炎症

组织学评估显示，OVA/SAL组小鼠支气管周围炎症显著重于CTRL/SAL组（p<0.0001）。FucCS和地塞米松均显著降低了支气管周围炎症指数（均p<0.0001 vs. OVA/SAL）。在肺实质中，OVA/SAL组多形核细胞浸润较CTRL/SAL组增加了385.3%（p<0.0001）。FucCS和地塞米松分别使多形核细胞密度降低63.5%（p<0.0001）和55.4%（p<0.0001）。

FucCS和地塞米松降低BALF总细胞数但不减少蛋白渗漏

OVA/SAL组BALF蛋白含量较CTRL/SAL组升高271%（p=0.0098），两种治疗均未显著改变这一升高。相比之下，OVA/SAL组BALF总细胞数较CTRL/SAL组显著增加1676%（p<0.0001）。FucCS和地塞米松分别使总细胞数显著降低60%（p=0.0035）和48.6%（p=0.0195）。分类计数显示，OVA/SAL组巨噬细胞比例较CTRL/SAL组降低64%（p<0.0001），嗜酸性粒细胞比例显著升高（+25,024%，p<0.0001）。FucCS和地塞米松均未显著改变嗜酸性粒细胞比例，各组间中性粒细胞和淋巴细胞比例无显著差异。

FucCS和地塞米松降低肺匀浆和BALF中的炎症介质

细胞因子分析显示，与CTRL/SAL组相比，OVA/SAL组肺匀浆IL-4水平增加204.5%，BALF中增加207.5%（p=0.0002）。FucCS治疗使肺组织和BALF中IL-4分别降低54.3%（p=0.0434）和69%（p<0.001），地塞米松仅使BALF中IL-4降低70.6%（p<0.0001）。肺匀浆中IL-5在OVA/SAL组较CTRL/SAL组升高345%（p<0.0001），FucCS使其降低48.5%（p=0.0007），地塞米松使其降低76.5%（p<0.0001）。各组间BALF中IL-5水平无显著差异。

四、讨论与结论

本研究探讨了从Holothuria grisea海参中纯化的FucCS在实验性过敏性气道炎症模型中的抗炎潜力。通过简化的盐析法获得了高纯度FucCS，并经琼脂糖凝胶电泳和NMR确认，与既往报道的结构特征一致。体内实验表明，FucCS治疗与地塞米松类似，可降低基础气道阻力、支气管周围和实质炎症、多形核细胞浸润、BALF总细胞数以及2型细胞因子IL-4和IL-5的水平。相比之下，两种治疗均未减轻肺泡-毛细血管通透性及BALF中嗜酸性粒细胞比例，提示其具有部分但显著的抗炎作用。

FucCS的抗炎作用归因于对L-和P-选择素的抑制，从而减少白细胞与活化内皮细胞的黏附和向炎症组织的迁移。值得注意的是，其抑制能力约为标准肝素的四倍，凸显了源自Holothuria grisea的FucCS作为哮喘及其他炎症性疾病抗炎治疗的 promising 候选分子的潜力。与哺乳动物来源的糖胺聚糖相比，FucCS具有较低的抗凝活性（约30 IU/mg），远低于普通肝素（约180 IU/mg），且可通过口服途径安全使用，动物经灌胃给予高剂量FucCS后出血时间与对照组相同。此外，该产物非哺乳动物来源，降低了交叉污染风险。

本研究的优势在于整合了严格的结构表征、简化的纯化策略和以临床相关对照（地塞米松）进行的全面体内评估，并聚焦于具有降低抗凝活性的非哺乳动物来源化合物，拓展了哮喘及其他炎症性肺病的治疗前景。然而，研究存在一定局限性：OVA诱导的急性哮喘模型未能引发气道高反应性；缺乏FucCS的剂量-反应实验；仅关注短期炎症终点，长期结局如气道重塑和功能恢复尚未探索；未进行直接的作用机制实验。

结论：研究人员提供了令人信服的临床前证据，表明源自Holothuria grisea的FucCS在实验性过敏性气道炎症中发挥有限但显著的抗炎作用。其部分疗效、良好的安全性特征和简化的纯化工艺支持其作为哮喘及其他急性肺部炎症性疾病新型治疗策略的进一步研究。未来研究应关注长期疗效、药代动力学评估、剂量优化、详细的作用机制以及在更接近人类哮喘表型的模型中的转化潜力。