《Journal of Pharmaceutical Analysis》：Integrated scRNA-Seq and CyTOF profiling decodes multi-target immune mechanism of nucleic acid polymers restoring anti-HBs immunity in chronic hepatitis B
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在降低乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的策略中，核酸聚合物（NAPs）已展现出诱导乙型肝炎表面抗体（anti-HBs）体液免疫的独特能力，提示其作用机制超越单纯的抗原清除。为阐明NAPs独特的药理作用，研究人员在携带1.3拷贝乙型肝炎病毒（HBV）基因组重组腺相
在降低乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的策略中，核酸聚合物（NAPs）已展现出诱导乙型肝炎表面抗体（anti-HBs）体液免疫的独特能力，提示其作用机制超越单纯的抗原清除。为阐明NAPs独特的药理作用，研究人员在携带1.3拷贝乙型肝炎病毒（HBV）基因组重组腺相关病毒血清型8（rAAV8-1.3HBV）的小鼠中采用整合多组学方法。单细胞RNA测序（scRNA-seq）阐明转录动力学与细胞间通讯网络，而飞行时间流式细胞术（CyTOF）提供免疫表型的高维蛋白水平验证。研究人员阐明了NAP诱导持续性高滴度anti-HBs产生的机制。在脾脏B细胞中，scRNA-seq揭示NAP处理下调抑制性受体Fcγ受体IIb（FCGR2B），并伴随核因子κB（NF-κB）通路激活与生发中心（GC）形成。CyTOF证实活化B细胞群体扩增。在肝脏浆细胞中，scRNA-seq揭示NAP上调白细胞介素（IL）-6信号转导子（IL6ST），增强白细胞介素6（IL-6）反应性与长寿性。此外，细胞间通讯分析揭示肝脏浆细胞主动促进CD8+ T细胞效应分化的新作用，CyTOF证实该CD8+ T细胞分化。此外，scRNA-seq揭示NAP损害免疫抑制细胞功能，而CyTOF证实其丰度降低。通过整合scRNA-seq与CyTOF，研究人员阐明了NAP诱导的持续性高滴度anti-HBs产生的多靶点免疫机制。本研究鉴定了维持高质量anti-HBs体液免疫所必需的合作性免疫通路。此外，这些发现可能为未来HBV免疫疗法开发提供新型治疗靶点的见解。
研究背景方面，慢性乙型肝炎（CHB）由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起，全球仍有2.54亿慢性携带者，终生面临15%–40%的肝硬化与肝细胞癌（HCC）风险。当前标准疗法包括核苷（酸）类似物（NAs）、聚乙二醇干扰素-α（PEG-IFNα）或其联合方案，HBsAg血清清除率不超过9%，且更少患者能产生抗-HBs体液免疫，表明现有方案无法恢复有效体液免疫。核酸聚合物（NAP）通过破坏亚病毒颗粒（SVPs）组装与分泌抑制HBsAg分泌。临床试验发现，在实现相似HBsAg下降的情况下，NAP诱导抗-HBs体液免疫的能力优于其他抗-HBV疗法：NAP单药治疗使38%（3/8）患者实现HBsAg血清清除且全部产生抗-HBs（峰值滴度1712 mIU/mL）；联合NAs与PEG-IFNα时60%（24/40）患者实现HBsAg血清清除，全部应答者产生高滴度抗-HBs（峰值滴度233,055 mIU/mL），14例在治疗后48周维持功能性治愈；HBV/HDV共感染患者中50%（6/12）实现HBsAg血清清除并产生抗-HBs，抗体持续长达一年。然而，siRNA（如Elebsiran）和ASO（如bepirovirsen）等其他降低HBsAg的疗法始终未能引发强健的抗-HBs体液免疫，这一鲜明对比表明HBsAg清除虽必要但不足以恢复有效抗-HBs体液免疫，NAP独特的临床特征提示存在尚未阐明的额外免疫调节机制。因此，阐明NAP独特的免疫学机制对于定义克服HBV诱导的体液免疫耐受策略至关重要。为此，研究人员采用整合scRNA-seq与CyTOF的多组学方法，在免疫耐受的rAAV8-1.3HBV小鼠模型中直接回答核心问题：在众多抑制HBsAg的策略中，为何NAP独能高效重建抗-HBs体液免疫。研究人员假设NAP的独特疗效源于其主动重塑宿主免疫景观、协调抗原特异性B细胞活化、长寿命浆细胞存活与效应CD8+ T细胞功能的能力。该论文发表在《Journal of Pharmaceutical Analysis》。
关键技术方法方面，研究采用rAAV8-1.3HBV载体小鼠模型（6周龄雄性C57BL/6小鼠静脉注射1×10^11 vg，注射后6周确认稳定携带状态后入组）；对肝、脾、外周血样本进行CyTOF高维蛋白表型分析；对肝、脾样本进行scRNA-seq转录组分析并结合Monocle 3拟时序、CellChat与NicheNet通讯分析；采用HBV肽段体外刺激与MHC-I四聚体检测HBV特异性CD8+ T细胞；开展体外NAP处理原代脾脏B细胞及浆细胞与肝脏非实质细胞（NPCs）共培养功能验证实验；并进行脾脏GC反应与浆细胞的动态分析。
研究结果方面，第一，NAP抑制HBsAg并构成抗-HBs体液免疫诱导的稳健模型。研究建立免疫耐受rAAV8-1.3HBV小鼠模型，评估30、60、90 mg/kg三个NAP剂量与恩替卡韦（ETV）及生理盐水组对比，各剂量均显著降低血清HBV DNA与HBsAg并诱导高滴度抗-HBs，仅90 mg/kg组实现100% HBsAg清除率且抗体滴度显著更高，安全性评估显示ALT与体重无异常，肝内HBsAg、HBV DNA与HBV RNA显著降低，停药后7周监测未见HBsAg反弹。CyTOF显示NAP显著增加CD8+ T、CD4+ T、B与NK细胞比例，降低Treg与髓源性抑制细胞（MDSCs）比例，MHC-I四聚体证实肝脾HBV特异性CD8+ T细胞显著增加。第二，scRNA-seq鉴定FCGR2B/NF-κB为恢复GC反应的关键检查点。脾脏B细胞拟时序分析显示盐水组活化滤泡B细胞（FoB）未能进入GC而直接分化为记忆B细胞，NAP组则促进FoB活化、GC反应与记忆分化的完整成熟；动态分析显示GC反应自第1周开始并持续。Cluster 1为B细胞进入GC的关键检查点，其高表达基因模块富集于B细胞受体（BCR）信号通路，Fcgr2b显著下调，体外实验证实NAP直接抑制原代脾B细胞FCGR2B。Moran's I分析显示轨迹相关基因富集于Module 10，显著富集于NF-κB信号通路，拟时序与体外实验均证实NAP激活NF-κB。CyTOF证实B细胞MHC-II上调、PD-1下调，血B细胞频率增加，脾浆细胞自第5周检出并持续扩增；GSEA显示脾浆细胞氨基酸生物合成、内质网蛋白加工与三羧酸（TCA）循环等代谢通路显著上调。第三，scRNA-seq揭示NAP通过增强IL-6/IL6ST信号维持浆细胞。肝脏浆细胞GSEA显示NAP抑制细胞衰老与铁死亡通路、激活氧化磷酸化与核糖体通路。CellChat显示盐水组肝脏浆细胞基本孤立，而NAP组浆细胞作为配体与受体主动参与形成广泛信号网络。NicheNet分析将Il-6列为靶向浆细胞的首位配体，配体主要来源于常规树突状细胞（cDCs）与M1巨噬细胞；NAP未增加cDCs或M1巨噬细胞的Il-6产生，但显著上调浆细胞IL6ST表达，免疫荧光（IF）证实IL6ST蛋白表达显著增加，表明NAP通过增强浆细胞对IL-6的敏感性而非增加IL-6可得性促进其存活。第四，scRNA-seq/CyTOF揭示新型浆细胞-CD8+ T细胞轴。CellChat显示NAP增加浆细胞向CD8+ T细胞的信号，NicheNet预测浆细胞来源信号影响CD8+ T细胞基因表达并富集于“白细胞分化调控”GO-BP条目。CD8+ T细胞拟时序显示NAP促进初始向效应细胞转变并驱动TeM内部转变，CyTOF验证该分化及TeM亚群重塑；Cluster 3（NAP诱导的TeM）富集能量代谢、细胞黏附、淋巴细胞活化与增殖模块，Cluster 5（NAP抑制的TeM）富集内质网应激、未折叠蛋白反应、巨自噬与凋亡模块，CyTOF证实NAP扩增PD-1^low亚群并抑制PD-1^high亚群。CD8+ Teff中NAP上调细胞毒基因，CyTOF证实CD69、T-bet与颗粒酶B高蛋白水平。体外共培养显示NAP处理小鼠肝脏CD138+浆细胞直接驱动初始CD8+ T细胞向效应与记忆亚群分化；NicheNet与CellChat汇聚预测MHC-I为关键配体，MHC-I抗体功能阻断完全消除浆细胞介导的CD8+ T细胞分化。第五，scRNA-seq与CyTOF汇聚于免疫抑制网络的抑制。CellChat显示NAP大幅消除肝脏Treg、MDSC与M2巨噬细胞向B细胞与CD4+ T细胞的抑制性信号；CyTOF证实肝脏Treg频率显著降低，scRNA-seq显示Treg中TGF-β信号通路关键分子下调；CyTOF显示MDSCs在肝、脾、外周血几乎被清除；M2巨噬细胞GSEA显示细胞因子-细胞因子受体相互作用通路下调且多种免疫抑制分子表达显著降低。第六，NAP不依赖抗原清除直接调节B细胞免疫。独立重复实验再现HBsAg清除、高滴度抗-HBs及脾GC B细胞与浆细胞扩增；以等效HBsAg降低剂量的NAP与ASO（Bepirovirsen类似物）对比，二者均降低HBsAg但仅NAP持续诱导高滴度抗-HBs；体外处理证实NAP直接活化B细胞表型，增强GC相关分子CD40与MHC-II及归巢受体CD62L表达，同时抑制PD-1。
讨论部分总结：临床试验显示NAP、ASO与siRNA均有效抑制HBsAg，但NAP单药治疗抗-HBs血清阳转率100%（8/8）且不依赖HBsAg清除，ASO单药仅42%（5/12），siRNA单药罕见，表明单纯抑制HBsAg不足以恢复功能性抗-HBs体液免疫，NAP具有独特免疫调节特征。第一，轨迹分析鉴定逆转B细胞耐受的关键分子检查点：慢性HBV感染中GC反应严重受损，B细胞分化偏向滤泡外途径或过早退出GC，产生非典型记忆B细胞与短寿命抗体分泌细胞；既往研究确立该损伤由B细胞抑制性受体（如FCGR2B）上调驱动，持续抑制BCR信号及下游NF-κB通路激活；本研究表明NAP下调FCGR2B并伴随NF-κB激活与功能性GC形成，支持通过调节B细胞内在抑制性检查点克服免疫耐受、产生高亲和力类别转换抗体的药理学策略。第二，阐明NAP如何确保抗体应答长寿性：持久抗体应答依赖长寿命浆细胞（LLPCs）的产生与维持；NAP不广泛增加细胞因子产生，而精确上调肝脏浆细胞IL6ST，为临床观察到的持久抗-HBs体液免疫提供可能解释。第三，基于scRNA-seq数据揭示浆细胞直接调控CD8+ T细胞分化与功能的新型免疫协同机制，提示NAP不仅恢复体液免疫还协同增强细胞免疫。此外，多组学方法证明NAP抑制Treg、MDSC与M2巨噬细胞等关键免疫抑制网络。上述效应协同构成NAP诱导的连贯多层免疫重建模块。研究局限性包括：rAAV8-1.3HBV模型缺乏功能性cccDNA、不能复现HBV持续核心机制与病毒自然传播，免疫耐受程度与机制不同于自然感染，抗原暴露时间短不能复现慢性感染患者的深度免疫耐受，T细胞功能障碍不能完全复现CHB患者的多方面损伤，需在人源化小鼠模型或NAP临床试验患者样本中进一步验证；FCGR2B下调与NF-κB激活、IL6ST上调与浆细胞长寿之间的因果关系主要依赖相关性证据，需功能获得与丧失实验验证；浆细胞经MHC-I依赖方式调控CD8+ T细胞分化的证据尚属初步，需条件性体内敲除模型验证；CyTOF（每组n=3–4）与scRNA-seq（3–4只动物混合为1个样本）样本量有限，但关键假设经正交方法独立验证。此外，NAP诱导的强效全身免疫激活需在临床应用中监测潜在免疫病理副作用；多项临床试验安全性评估显示NAP安全性良好，未发生归因于NAP治疗的严重不良事件，即使产生极高抗-HBs滴度亦无显著不良事件；非严重不良事件主要为免疫治疗相关全身症状（发热、寒战、肌痛、瘙痒）自行缓解，以及约95%受试者出现超过正常上限三倍的ALT与AST升高，该升高发生于HBsAg与HBV DNA初始下降之后、继续NAP治疗可自行缓解、无肝功能障碍症状或血清学证据，且与后续功能性治愈相关，被视为肝脏免疫功能再激活的证据。
研究结论翻译：总之，通过整合scRNA-seq与CyTOF的多组学分析，研究人员将NAP的独特疗效解码为一组明确的协同机制。本研究证明实现HBV功能性治愈需要超越病毒抑制、转向主动的多靶点免疫重建。所鉴定的靶点特别是FCGR2B与IL-6/IL6ST轴，可能为未来HBV免疫疗法开发提供新型治疗策略的见解。本研究进一步支持HBV治疗成功不仅由抗原降低定义，还由强效、协调且持久免疫应答的全身性恢复来定义。
