基于热烧伤诱导微囊泡颗粒释放的鼻上皮作为酸性鞘磷脂酶活性微创检测替代组织的研究

《Journal of Pharmacological and Toxicological Methods》：Use of nasal epithelium as a minimally invasive surrogate for testing acid sphingomyelinase activity through thermal burn injury-induced microvesicle particle release

　　

皮肤角质形成细胞中的酸性鞘磷脂酶（ASM）在亚细胞微囊泡颗粒（MVP）的产生中至关重要，后者与皮肤对多种环境应激源（包括中波紫外线（UVB）辐射和热烧伤损伤（TBI））的反应有关。此外，ASM是治疗从代谢性疾病到病毒感染等多种全身性疾病的潜在药理靶点。然而，确认ASM被抑制的能力仍是一个治疗上的空白。当前研究旨在检验鼻上皮是否可通过利用MVP释放，作为一种微创的ASM活性检测方法。在这些研究中，研究人员从人类志愿者获取鼻上皮冲洗液，并在体外以实验性TBI进行处理，通过MVP定量来评估ASM活性。研究人员使用鼻刷从20名健康成年志愿者获取上皮细胞。组织学特征分析和泛细胞角蛋白染色显示，上皮细胞和杯状细胞的数量大致相等。用实验性TBI处理新鲜上皮细胞，导致MVP数量出现相当可重复性的增加，而这种增加可被ASM抑制剂丙咪嗪和阿米替林阻断。这些研究提供了一种简单的方法，可用于评估全身性药物对ASM的抑制效果，这些药物可能被用于治疗与ASM相关的病理状况，包括光敏性、急性TBI以及包括COVID在内的病毒感染。 口服酸性鞘磷脂酶抑制剂是治疗皮肤疾病的潜在途径。 直接评估酸性鞘磷脂酶抑制水平的能力是一个方法学上的空白。 当前研究表明，采集鼻上皮以测量微囊泡颗粒释放，可提供一种解决该问题所需的方法学。

论文解读文章

一、研究背景与问题提出

酸性鞘磷脂酶（ASM）是一种催化鞘磷脂分解为神经酰胺和磷酸胆碱的酶，近年来因其在多种病理过程中的参与而受到广泛关注，涉及范围从环境性皮肤损伤、代谢性疾病到呼吸道病毒感染。ASM存在溶酶体型和游离型两种形式，其中溶酶体型ASM研究最为深入。鉴于ASM在多种病理过程中的调控作用，该酶已成为药物研发的重要靶点。多种药物被证实可作为ASM的有效抑制剂，其中功能性酸性鞘磷脂酶抑制剂（FIASM）属于弱碱性化合物，其作用机制被认为是通过升高溶酶体pH值，导致ASM从溶酶体内膜释放并被降解。

FIASM已在多种临床前疾病模型中显示出疗效。例如，全身性给予丙咪嗪可阻断小鼠乙醇诱导的肝脂肪变性；局部应用FIASM可阻断小鼠热烧伤损伤（TBI）诱导的全身性病理反应以及人类中波紫外线（UVB）辐射诱导的红斑反应。涉及ASM抑制剂的临床试验也已有报道。然而，在采用FIASM的研究中一个主要关切问题是该药物是否能有效阻断ASM酶活性。人体皮肤研究常采用刮取或打孔活检等方法评估干预措施引起的变化，但这些方法具有侵入性，可能使患者面临感染风险和不适感。因此，直接评估ASM抑制水平的能力成为一个重要的方法学空白。

既往研究已证实，人体皮肤可用于测试包括TBI在内的多种环境应激源如何产生亚细胞微囊泡颗粒（MVP），即直径约100-1000纳米的膜结合囊泡，其释放依赖于ASM，且可被FIASM如丙咪嗪所减弱。小鼠和人类模型研究已提示MVP是皮肤损伤（UVB和TBI）引起全身效应的重要介质。近期研究开始关注利用从志愿者获取的鼻上皮来研究ASM在呼吸道病毒（包括SARS-CoV-2）发病机制中的作用，已有研究证实局部应用（氨溴索）和全身口服（阿米替林）ASM药理抑制剂可阻断志愿者鼻上皮的ASM活性。基于上述背景，本研究旨在探讨鼻上皮是否可作为人体皮肤的替代组织，用于检测TBI诱导的、且依赖ASM的MVP释放过程。

二、研究目的与设计

本研究的目标是探究鼻上皮能否作为人体皮肤的替代物，用于检测TBI诱导的MVP释放这一ASM依赖性过程。研究人员采用已报道的鼻上皮采集方法，进一步对鼻上皮成分进行了特征鉴定，并将实验性TBI后的MVP释放水平与人类角质形成细胞原代培养物及角质形成细胞来源的HaCaT细胞系进行比较。此外，研究还测试了使用FIASM（丙咪嗪和阿米替林）进行药理学抑制能否减弱TBI诱导的MVP释放。

三、主要关键技术方法

研究人员从22名符合入选标准的健康成年志愿者（年龄21-79岁）获取鼻上皮样本，其中20名志愿者使用牙间刷（Proxabrush?，Sunstar公司，瑞士埃图瓦）采集，该工具经比较被证明是最舒适且能提供足够细胞数量的方法。采集的细胞经离心、重悬后进行体外实验性TBI处理（将密封管浸入90°C水浴30秒），部分实验在TBI前用丙咪嗪（50 μM）或阿米替林（50 μM）预处理1小时，随后在37°C孵育2小时。MVP定量采用差速离心结合纳米颗粒追踪分析（NanoSight NS300）完成。细胞特征鉴定采用苏木精-伊红（H&E）染色和泛细胞角蛋白染色。研究经莱特州立大学机构审查委员会批准（IRB # 2025-828），遵循《赫尔辛基宣言》原则，所有志愿者均签署书面知情同意书。

四、研究结果

鼻上皮的特征鉴定

研究人员对22名健康志愿者（年龄21-79岁）进行样本采集，其中2名志愿者用于测试不同采集装置（刷子与塑料刮匙），20名使用牙间刷的志愿者数据用于研究。使用最优刷具时，每个鼻孔样本可获得7.7 × 10⁵个细胞（标准差7.8 × 10⁵），与既往报道的研究数量相当。组织学分析显示上皮细胞（部分呈粘附聚集体）具有丰富的粉红色胞浆和圆形嗜碱性胞核，以及含有胞浆内球状物的淡嗜碱性杯状细胞。泛细胞角蛋白染色显示约50%的细胞呈阳性，表明所获原代细胞由角蛋白阳性上皮细胞和杯状细胞组成。

TBI对MVP释放的影响

既往研究已证明TBI是体外角质形成细胞、体外人体皮肤外植体和体内小鼠皮肤中MVP释放的强效刺激因素。实验性TBI在鼻上皮样本中诱导了显著的MVP释放增加。鼻上皮原代样本的假处理MVP释放水平（1.2-1.7 × 10⁷/10⁵细胞）略低于人类角质形成细胞原代培养物（2.0-2.8 × 10⁷/10⁵细胞）和HaCaT细胞系（2.0-3.4 × 10⁷/10⁵细胞）。30秒实验性TBI后MVP的倍数增加在鼻上皮中也略低于角质形成细胞原代培养物，且与永生化HaCaT细胞系相比，鼻上皮的MVP释放倍数增加在统计学上显著较低。这些研究表明鼻上皮对实验性TBI的MVP释放反应方式与皮肤来源的上皮细胞相似，但强度较低。

ASM抑制剂对MVP释放的影响

既往研究已证实HaCaT角质形成细胞体外、人体皮肤外植体体外和小鼠皮肤体内的TBI诱导MVP释放依赖于ASM酶，这些研究不仅使用了小鼠ASM缺陷（Smpd1^-/-）模型，还使用了药理ASM抑制剂。为评估鼻上皮细胞TBI诱导的MVP释放是否依赖ASM，研究人员在TBI前用FIASM丙咪嗪（50 μM）或阿米替林（50 μM）预处理细胞。结果显示，单独使用丙咪嗪或阿米替林处理的样本，其MVP水平与对照组相当。热损伤产生的MVP较基线显著增加（p < 0.05），而在损伤前应用FIASM可有效将其降至接近对照水平。尽管不同受试者间MVP释放数量存在相当大差异，但FIASM（阿米替林或丙咪嗪）处理均一致地将每个样本的MVP释放可靠地抑制至对照值。这些研究表明鼻上皮TBI诱导的MVP释放依赖于ASM。

五、讨论与结论

这些研究提示鼻上皮细胞可作为角质形成细胞在研究MVP释放及其抑制方面的合适替代组织。牙间刷模型相比塑料或金属刮匙等工具侵入性更小、不适感更低。实验性TBI产生了预期的MVP显著增加，且其释放可被FIASM丙咪嗪和阿米替林预处理成功阻断。该微创采样方法不仅可用于MVP相关皮肤研究，还有助于在口服FIASM的临床研究中最大程度减少患者不适和风险，从而确认充分的ASM抑制效果。近期研究已使用单次口服FIASM阿替林并观察到鼻上皮ASM抑制持续长达24小时。已知FIASM如帕罗西汀已被证明可改善光敏性皮肤病酒渣鼻。大量证据表明全身性ASM抑制可有效预防SARS-CoV-2感染，因为该病毒利用ASM/神经酰胺系统进入细胞。ASM还可能成为囊性纤维化的治疗靶点，临床前研究证据提示FIASM可减轻肺部炎症并改善呼吸功能。因此，这种微创鼻上皮采样方案在评估全身性FIASM抑制ASM酶活性以确保适当药物剂量方面具有潜在应用价值。

本研究存在的局限性包括：未对鼻上皮MVP释放进行正式的时间过程研究；鼻上皮培养物并非100%纯细胞。该方案的优点在于鼻上皮可取自两个鼻孔，可设计两个不同时间点的采样，例如在口服FIASM给药前后采样，可为FIASM的有效性提供重要信息。虽然该方法在检测口服FIASM后上皮ASM水平方面具有若干优势，但另一局限性是需要专门的设备来检测MVP，特别是颗粒计数装置虽然可靠但价格昂贵。此外，该检测方法基于TBI诱导的MVP释放依赖ASM这一假设，正在进行的基因编辑研究表明缺乏ASM的HaCaT细胞在TBI后无法释放增加的MVP。这种微创技术可能优于检测血液ASM活性水平，因为其能够更好地定义皮肤ASM状态。

研究结论：当前研究表明，获取鼻上皮以基于体外烧伤损伤产生的MVP来评估ASM活性的程序，是一种相对简单、微创且可重复的评估FIASM有效性的检测方法。鼻上皮的MVP释放水平与原发性角质形成细胞和HaCaT角质形成细胞系产生的水平相似。未来研究应确定该采样方法在不同刺激、干预措施和抑制剂条件下的表现。