《Clinical and Translational Medicine》：Zdhhc14 promotes pyroptosis in the dorsal root ganglion of oxaliplatin-induced peripheral neuropathy mice by enhancing GBP5 palmitoylation and suppressing its ubiquitination
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背景：奥沙利铂相关神经病变（OIPN）仍是化疗引起的常见并发症，其潜在机制尚未完全阐明。新近证据提示细胞焦亡参与OIPN的发病过程，而棕榈酰化已被认为是神经系统疾病中的关键机制。目的：本研究旨在考察棕榈酰转移酶Zdhhc14在OIPN细胞焦亡中的作用，并阐明其
背景：奥沙利铂相关神经病变（OIPN）仍是化疗引起的常见并发症，其潜在机制尚未完全阐明。新近证据提示细胞焦亡参与OIPN的发病过程，而棕榈酰化已被认为是神经系统疾病中的关键机制。目的：本研究旨在考察棕榈酰转移酶Zdhhc14在OIPN细胞焦亡中的作用，并阐明其基本分子过程。方法：通过腹腔注射奥沙利铂构建OIPN小鼠模型，并将来源于背根神经节（DRG）的原代神经元培养物暴露于奥沙利铂以在体外模拟OIPN。使用GSE255097数据集进行生物信息学分析。通过实时定量PCR、Western blot和免疫荧光染色检测基因和蛋白表达。通过乳酸脱氢酶释放、流式细胞术和细胞焦亡相关蛋白检测评估细胞焦亡。应用免疫共沉淀、免疫沉淀和放线菌酮（CHX）追踪实验评估相关机制。结果：Zdhhc14在OIPN小鼠DRG中以时间依赖方式显著上调。Zdhhc14缺失减轻了OIPN表型，包括机械性痛觉过敏和冷异常性疼痛、神经炎症及DRG细胞焦亡。机制上，Zdhhc14与GBP5结合并促进其在Cys12位点的修饰，该修饰为Zdhhc14介导的抑制K48连接泛素化及随后蛋白酶体降解所必需，从而稳定GBP5。GBP5敲低可复制Zdhhc14缺失的保护效应，而GBP5过表达则逆转这些效应。重要的是，GBP5棕榈酰化位点突变消除了Zdhhc14的促细胞焦亡效应。结论：这些发现表明，Zdhhc14/GBP5棕榈酰化轴关键调控OIPN中的DRG细胞焦亡和神经炎症，揭示了一种新机制以及一个值得进一步转化评估的潜在机制性靶点。
研究背景与问题：奥沙利铂（L-OHP）是第三代铂类细胞毒药物，常用于胃肠道肿瘤尤其是结直肠癌和胃癌的治疗，但其剂量限制性神经毒性可表现为急性和慢性周围神经病变，其中奥沙利铂诱导的周围神经病变（OIPN）是最常见且严重的不良反应，临床以感觉异常为特征，常伴冷诱发的感觉异常，往往迫使减量或终止治疗，削弱疗效并显著降低患者生活质量。OIPN病因复杂，涉及离子通道失调、氧化负荷、神经炎症反应及背根神经节（DRG）神经元损伤，其中神经炎症是关键致病介质。细胞焦亡是一种促炎性程序性细胞死亡形式，由caspase-1介导的蛋白水解启动，促进孔道形成及白细胞介素（IL）-1β和IL-18释放，从而加剧炎症环境；细胞焦亡已被明确牵涉OIPN动物模型的进展，但其调控与疾病病理相联系的确切信号通路仍知之甚少。棕榈酰化作为一种动态脂酰化修饰，可逆地将棕榈酸连接至蛋白半胱氨酸残基，调控蛋白膜锚定、代谢稳定性、分子间接触及整体生物活性，并广泛参与神经系统疾病的发生；已有研究提示棕榈酰化参与周围神经病变，损伤的周围神经中棕榈酰化酶及其底物存在失调。锌指DHHC型含14（Zdhhc14）是催化蛋白棕榈酰化的DHHC棕榈酰转移酶家族成员，但其神经领域作用 largely 未知，其在OIPN中的功能及机制基础尚待探索。基于此，研究人员构建L-OHP诱导的OIPN小鼠模型，考察Zdhhc14在该模型中的表达及其通过棕榈酰化调控OIPN小鼠细胞焦亡的机制，以期为该疾病提供新的机制性靶点。
研究内容与结论：研究人员发现Zdhhc14在OIPN小鼠DRG中呈时间依赖性上调并主要定位于DRG神经元；Zdhhc14缺失可减轻机械性痛觉过敏、冷异常性疼痛、神经炎症及DRG细胞焦亡；机制上Zdhhc14与GBP5结合，促进其Cys12位点依赖的修饰，抑制K48连接泛素化及蛋白酶体降解，从而稳定GBP5；GBP5敲低可复制Zdhhc14缺失的保护效应，而GBP5过表达可逆转该效应，GBP5棕榈酰化位点突变则消除Zdhhc14的促细胞焦亡作用。研究表明Zdhhc14/GBP5棕榈酰化轴关键调控OIPN中的DRG细胞焦亡与神经炎症，揭示了新机制并提示潜在的机制性靶点，但其治疗适用性尚待确立，本研究结论应视为临床前机制证据而非已验证的治疗策略。
关键技术方法（不超过250字）：研究人员利用公共基因表达数据集GSE255097（含L-OHP处理与假手术对照C57BL/6小鼠坐骨神经血管样本各6个生物学重复）进行生物信息学分析；构建L-OHP腹腔注射OIPN小鼠模型及Zdhhc14基因敲除小鼠，采用AAV9载体经腓肠肌注射或鞘内注射实现Gbp5敲低/过表达及HA-泛素（HA-UB）野生型、K48R、K63R突变体递送；分离DRG原代神经元富集培养物并以0.1 μg/mL L-OHP处理48 h建立体外模型；采用qPCR、Western blot、免疫荧光（IF）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、乳酸脱氢酶（LDH）释放实验、流式细胞术、免疫共沉淀（Co-IP）、免疫沉淀、放线菌酮（CHX）追踪、酰基-生物素交换（ABE）实验、免疫沉淀-质谱（IP-MS）、分子动力学模拟及结构建模分析。
研究结果：（1）Zdhhc14在L-OHP处理小鼠DRG中上调：通过GSE255097数据集差异表达基因分析与棕榈酰化相关基因聚类，结合OIPN小鼠模型行为学、HE染色、qPCR、Western blot及IF，发现Zdhhc14在L-OHP诱导后第1天即显著升高并随时间持续上调，主要与神经元标记NeuN共定位，原代DRG神经元中mRNA、蛋白及表达强度均显著升高。（2）L-OHP诱导OIPN小鼠细胞焦亡增加：通过KEGG通路富集分析提示细胞焦亡通路富集，并以细胞焦亡抑制剂VX-765干预，发现其可恢复机械性痛觉过敏、减轻冷异常性疼痛、降低血浆及DRG中IL-18、IL-1β、IL-6、TNF-α水平并下调NLRP3、GSDMD-N、CL-CASP1蛋白。（3）Zdhhc14缺失抑制L-OHP诱导的OIPN表型及细胞焦亡：通过Zdhhc14敲除小鼠结合行为学、HE染色、ELISA及Western blot，发现Zdhhc14缺失显著提高机械痛阈、减轻冷异常性疼痛与DRG组织损伤，降低炎症因子及细胞焦亡核心蛋白水平，且Zdhhc14缺失联合生理盐水组与野生型联合生理盐水组间无显著差异。（4）Zdhhc14敲低抑制L-OHP诱导的DRG神经元富集培养物细胞焦亡：通过shZdhhc14转染结合LDH释放、ELISA、流式细胞术及Western blot，发现Zdhhc14敲低降低LDH释放、IL-18与IL-1β水平、细胞焦亡率及NLRP3、GSDMD-N、CL-CASP1表达。（5）ZDHHC14通过Cys12依赖修饰及抑制K48连接泛素化降解增强GBP5蛋白稳定性：通过IP-MS、Co-IP、ABE、IF、CHX追踪、泛素化实验、位点突变、结构域截短体定位、分子动力学模拟及AlphaFold3结构分析，发现ZDHHC14与GBP5存在物理结合并共定位，ZDHHC14过表达提高GBP5棕榈酰化与蛋白水平、延长其半衰期、降低其泛素化，K48R突变使该效应消失，C12S突变消除ZDHHC14对GBP5棕榈酰化及蛋白水平的提升作用；GBP5结合区定位在ZDHHC14的351–488氨基酸残基，ZDHHC14结合区定位在GBP5的C端螺旋结构域，关键残基突变（Zdhhc14 L378A、T423A；GBP5 R499A、R515A、Q437A）显著削弱二者互作；催化失活型ZDHHC14突变体不能抑制GBP5的K48连接泛素化并加速其降解。（6）GBP5敲低抑制L-OHP诱导的OIPN表型及细胞焦亡：通过AAV9递送shGbp5或Gbp5过表达载体结合行为学、HE染色、ELISA及Western blot，发现GBP5敲低提高机械痛阈、减轻冷异常性疼痛与DRG损伤、降低炎症因子及细胞焦亡核心蛋白水平，而Zdhhc14缺失小鼠中GBP5过表达则逆转上述保护效应。（7）GBP5过表达逆转Zdhhc14敲低对L-OHP诱导DRG神经元富集培养物细胞焦亡的抑制作用：通过共转染结合LDH释放、ELISA、流式细胞术及Western blot，发现shZdhhc14+oeGBP5组较shZdhhc14+oeNC组LDH释放、IL-18/IL-1β、细胞焦亡率及NLRP3、GSDMD-N、CL-CASP1表达均升高，且Zdhhc14过表达引起的效应可被GBP5敲低抑制。（8）Zdhhc14经GBP5棕榈酰化促进L-OHP诱导的DRG神经元细胞焦亡：通过Zdhhc14过表达质粒转染结合上述指标检测，发现GBP5-WT背景下Zdhhc14过表达进一步加剧LDH释放、炎症因子释放、细胞焦亡及细胞焦亡核心蛋白表达，而GBP5棕榈酰化缺陷突变背景下Zdhhc14过表达未引起显著变化，表明GBP5棕榈酰化是Zdhhc14调控OIPN中DRG细胞焦亡的关键分子机制。
讨论与结论总结：讨论部分指出，本研究首次将Zdhhc14与OIPN相联系，填补了周围神经病变文献的空白，并发现其主要定位于DRG神经元，与既往海马神经元中的表达模式相呼应；OIPN小鼠模型及DRG神经元富集培养物中细胞焦亡显著升高并伴全身及神经炎症，Zdhhc14缺失或敲低可抑制细胞焦亡与炎症反应，提示DRG神经元中细胞焦亡升高可能是OIPN加重的关键驱动因素；虽然VX-765特异性并非绝对，但各实验组中GSDMD-N的一致检测为GSDMD介导的细胞焦亡提供了最直接证据；与既往聚焦小胶质细胞和DRG巨噬细胞的研究不同，本研究提供了DRG神经元内细胞焦亡参与OIPN的证据，但需承认该神经元贡献是在全身性Zdhhc14敲除背景下观察到的，而非感觉神经元特异性操作；研究证实Zdhhc14通过Cys12依赖机制增强GBP5蛋白稳定性并抑制其泛素化介导的降解，但C12S突变也可能影响棕榈酰化以外的半胱氨酸修饰；本研究首次证明Zdhhc14介导的GBP5 Cys12棕榈酰化通过促进DRG神经元细胞焦亡参与OIPN进展，揭示了棕榈酰化驱动OIPN的新机制及Zdhhc14介导GBP5棕榈酰化的新调控位点；GBP5作为NLRP3炎症小体的关键激活因子，其促炎功能在免疫细胞和实质细胞中已被广泛验证，本研究首次揭示棕榈酰化-泛素化交互调控在GBP5介导神经元细胞焦亡中的作用。局限性包括：调控Zdhhc14表达的上游信号尚未完全阐明；DRG内其他细胞类型（如卫星胶质细胞）中该级联的潜在参与有待研究；GFAP与IBA1作为非神经元DRG细胞标记物存在已知局限；全身性Zdhhc14敲除小鼠不能排除非神经元细胞的间接效应，DRG神经元自主性作用尚未证实，需条件性敲除模型；缺乏C12S突变小鼠体内位点特异性回补实验；未评估靶向该通路是否影响奥沙利铂抗肿瘤疗效；所有动物实验及原代DRG神经元分离仅使用雄性小鼠，结论限于雄性OIPN，可能不适用于雌性。研究结论翻译：总之，研究人员证明Zdhhc14在L-OHP诱导的OIPN小鼠DRG中上调，其促进GBP5棕榈酰化并抑制其泛素化介导的降解，从而增强GBP5蛋白稳定性并 consequently 加剧DRG细胞焦亡；鉴于上述局限性——包括缺乏药理学可及的Zdhhc14选择性干预手段、未在人感觉神经元或临床OIPN标本中验证、仅使用雄性小鼠、非细胞类型特异性遗传学方法以及对抗肿瘤疗效的影响未知——研究人员认为Zdhhc14/GBP5通路代表一个值得进一步转化评估的潜在机制性靶点，而非可立即实施治疗的可及策略。
