m6A依赖性IGF2BP2通过正反馈环稳定circSMAD4并激活JAK2/STAT3与EMT信号促进胆囊癌进展

《Clinical and Translational Medicine》：Circular RNA SMAD4 coordinates with m6A-dependent IGF2BP2 to promote gallbladder cancer development

　　

环状RNA（circRNA）已通过微小RNA海绵、蛋白翻译及与RNA结合蛋白互作等机制成为肿瘤发生的重要调控因子。本研究鉴定了一种新型circRNA，命名为circSMAD4，其由SMAD4前体mRNA经可变剪接从外显子2至外显子10再回到外显子2起始处生成，构成1435个核苷酸的环状RNA。circSMAD4在胆囊癌（GBC）组织中表达上调并与癌症进展正相关。circSMAD4表达升高及致瘤活性主要依赖其与IGF2BP2的互作，位于IGF2BP2 KH3和KH4结构域的m⁶A结合基序识别并结合circSMAD4的侧翼内含子序列。在细胞质中，IGF2BP2稳定circSMAD4水平，而circSMAD4反过来抑制IGF2BP2的泛素化与降解，从而形成二者表达升高的正反馈环。circSMAD4与IGF2BP2协同激活JAK2/STAT3及上皮–间质转化（EMT）信号。值得注意的是，使用干扰IGF2BP2与circRNA结合的小分子CWI1-2治疗异种移植小鼠模型，可减少circSMAD4诱导的肿瘤发展。总之，研究结果表明circSMAD4与IGF2BP2协同促进肿瘤进展，突显circSMAD4-IGF2BP2复合物作为GBC潜在治疗靶点。

研究背景方面，胆囊癌（GBC）是胆道系统最常见且侵袭性最强的恶性肿瘤，5年生存率约为5%～10%，手术切除是唯一可能治愈的手段，但多数患者初诊时已处晚期而失去手术机会。既往针对RAS、TP53、SMAD4、ERBB2/3等基因突变及编码蛋白与非编码RNA等分子调控因子的靶向治疗疗效有限，预后仍差，因此全面理解这些分子的相互作用与机制调控成为重要挑战。环状RNA（circRNA）为共价闭合单链RNA分子，主要通过反向剪接生成，缺乏游离5′和3′末端而耐受外切酶降解，其生成受顺式元件与反式因子（包括RNA结合蛋白RBP和剪接体组分）严格调控。circRNA可在细胞质中作为微小RNA诱饵、调控RBP、影响RNA稳定性与翻译，在细胞核中亦可调控转录与可变剪接。N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是mRNA和非编码RNA中最普遍的表观修饰之一，由写入器、阅读器和擦除器动态调控，异常m⁶A修饰可介导肿瘤发生与进展，但circRNA前体及成熟circRNA上m⁶A修饰的丰度与功能意义尚不明确。SMAD4是经典TGF-β信号的核心介导者，也可通过非经典蛋白互作发挥功能。既往报道的circSMAD4（hsa_circ_0047718）与本研究所关注的hsa_circ_0108590不同，后者由SMAD4基因外显子2–10生成，其在GBC中的生物学功能与调控机制尚属未知；同时m⁶A阅读器IGF2BP2在GBC中高表达并参与RNA稳定性与翻译调控。因此，研究人员提出IGF2BP2是否调控hsa_circ_0108590的生成与功能、该circRNA是否通过独特信号机制促进GBC进展这一关键科学问题。研究人员开展了circRNA测序、临床样本分析、功能获得与缺失实验、机制解析及异种移植模型研究，得出circSMAD4在GBC中上调并与不良预后相关，IGF2BP2通过m⁶A依赖方式促进circSMAD4生成，二者相互稳定形成正反馈环并激活JAK2/STAT3与EMT信号，小分子CWI1-2可破坏该互作并抑制肿瘤生长的结论。其重要意义在于首次提供hsa_circ_0108590与IGF2BP2协同促进GBC进展的机制证据，将circSMAD4/IGF2BP2轴确立为潜在治疗靶点，并揭示IGF2BP2作为circRNA生物生成上游调控者与下游效应器的双功能RBP特性。

关键技术方法方面，研究人员收集了2020至2024年上海交通大学医学院附属仁济医院手术切除的65例GBC患者肿瘤及配对癌旁组织（仁济队列），并采用NOZ、GBC-SD、ZJU-0430、OCUG-1、EHGB-1等GBC细胞系及正常胆囊上皮细胞系L-2F7；主要技术包括circRNA测序、qRT-PCR、Sanger测序、Northern blotting、RNase R与放线菌素D处理、核质分离与RNA荧光原位杂交（FISH）、RNA免疫沉淀（RIP）、甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）、RNA pulldown联合质谱（MS）、co-IP与泛素化实验、bulk RNA测序及基因集富集分析（GSEA）、皮下裸鼠异种移植模型及CWI1-2治疗实验。

研究结果方面，第一，circSMAD4在GBC细胞与组织中的特征与表达：通过对3对GBC组织及癌旁组织circRNA测序，鉴定hsa_circ_0108590为SMAD4位点来源且在3例GBC组织中均高表达的circRNA；Sanger测序、Northern blotting及RNase R耐受实验确认其为环状结构，放线菌素D实验显示其半衰期超过24 h而SMAD4 mRNA约2 h，核质分离与FISH显示其主要定位于细胞质；circSMAD4在4种GBC细胞系中较L-2F7高2–3.2倍，在30对GBC组织中显著上调而SMAD4 mRNA无差异，smFISH在21对组织中验证其约高3倍；扩大至65例队列显示circSMAD4水平与肿瘤大小、T分期及TNM分期正相关，高表达患者总生存约1年而低表达约5年。第二，circSMAD4促进GBC细胞增殖与迁移：采用靶向反向剪接接头的两条siRNA敲低及过表达质粒，CCK-8、EdU及克隆形成实验显示敲低降低细胞活力、过表达促进生长，Transwell实验显示敲低抑制迁移、过表达诱导迁移；通过构建缺乏环化所需Alu元件的lin-circSMAD4对照，体外与体内实验均表明线性转录本不足以解释促瘤效应，支持环状RNA本身的主导作用。第三，RNA结合蛋白IGF2BP2诱导GBC中circSMAD4表达：通过ENCORI与circAtlas 2.0数据库交集获得7个候选RBP，敲低与过表达筛选显示IGF2BP2可上调circSMAD4；IGF2BP2在GBC细胞系及30对组织中表达升高并与circSMAD4正相关，Western blot显示9对中6对（66.7%）高表达，IHC显示32例中46.9%强表达，65例队列中IGF2BP2 H评分与circSMAD4强正相关（r=0.6408，p<0.0001）；敲低IGF2BP2加速circSMAD4降解，且circSMAD4过表达可挽救IGF2BP2敲低所致的迁移、活力与克隆形成能力下降，表明IGF2BP2为circSMAD4上游调控者而circSMAD4为其下游效应器。第四，IGF2BP2对circSMAD4的诱导依赖m⁶A识别基序：构建FLAG标签IGF2BP2系列缺失突变体，仅ΔKH1-4与ΔKH3-4不能诱导circSMAD4，表明KH3-4结构域必需；将KH3与KH4的GxxG基序突变为GEEG，单点突变仍可增强circSMAD4而双突变丧失该能力，且在敲低背景下WT可恢复circSMAD4而KH3-4双突变不能；SRAMP预测结合MeRIP、RIP及RNA pulldown实验证实IGF2BP2特异性结合circSMAD4侧翼内含子中m⁶A修饰位点a、c、d而非b、e，KH3-4突变体丧失该互作；功能实验显示circSMAD4过表达可挽救IGF2BP2敲低所致迁移与生长抑制。第五，IGF2BP2通过KH3-4结构域调控成熟circSMAD4的亚细胞定位与结合：核质分离显示circSMAD4主要位于GBC细胞质而L-2F7中分布均匀，IGF2BP2 mRNA在L-2F7中主要滞留核内而在GBC细胞中富集于细胞质；过表达IGF2BP2增加circSMAD4胞质定位而敲低导致其核滞留；KH3-4双突变可挽救敲低所致核滞留而ΔKH3-4缺失突变不能，单独ΔKH3或ΔKH4亦不能，FISH-IF验证一致，表明核输出依赖KH3-4结构域但不依赖m⁶A识别基序；MeRIP证实circSMAD4存在强m⁶A修饰，KH3或KH4单点突变不改变circSMAD4与IGF2BP2互作，单独缺失KH3或KH4即抑制互作而双缺失完全破坏结合。第六，circSMAD4通过抑制泛素化介导的降解增强IGF2BP2表达：TransCirc预测存在开放阅读框但FLAG标记未检测到翻译产物，核糖体谱分析未见circSMAD4与多聚核糖体结合，Ago2 RIP未见富集，排除经典翻译与微小RNA海绵机制；RNA pulldown联合质谱鉴定IGF2BP2为circSMAD4结合蛋白，pulldown-WB与FISH共定位验证二者在细胞质结合；circSMAD4过表达或敲低不改变IGF2BP2 mRNA水平但分别升高或降低其蛋白水平；CHX实验显示circSMAD4过表达减缓IGF2BP2蛋白降解，co-IP显示circSMAD4过表达降低而敲低增加IGF2BP2多聚泛素化水平，表明circSMAD4通过抑制泛素化降解稳定IGF2BP2蛋白。第七，circSMAD4通过激活IGF2BP2/JAK2/STAT3信号轴驱动胆囊癌：对稳定过表达circSMAD4的GBC-SD细胞行bulk RNA测序，GSEA显示IL-6/JAK/STAT3与EMT通路显著上调；Western blot显示circSMAD4过表达增加间质标志物N-cadherin、MMP-9及磷酸化JAK2与STAT3而降低上皮标志物E-cadherin，总JAK2与STAT3不变；CWI1-2处理24 h显著减少circSMAD4与IGF2BP2的互作而不降低IGF2BP2丰度，并逆转circSMAD4诱导的EMT与JAK2/STAT3激活及增殖迁移增强；体内实验中CWI1-2每3天静脉注射共7次显著减小circSMAD4驱动的肿瘤体积而不明显影响体重，H&E与IHC显示IGF2BP2、Ki-67及磷酸化STAT3升高均被CWI1-2恢复至近基线水平。

讨论部分总结：研究人员将hsa_circ_0108590（circSMAD4）鉴定为GBC进展的致癌调控因子，其生物生成与环化依赖IGF2BP2以m⁶A依赖方式的结合活性，KH3与KH4结构域中的GxxG基序为m⁶A识别所必需，侧翼内含子含G/AACU基序的位点a、c、d决定其与IGF2BP2结合；研究同时指出RBP介导的调控可能不限于侧翼内含子，精确结合序列及单个m⁶A位点尚待单核苷酸分辨率定位确定。circSMAD4在GBC中显著上调而线性SMAD4 mRNA不变，提示其独立于宿主基因调控，但本研究未直接检测经典TGF-β级联，不能排除其贡献。circSMAD4过表达降低而敲低增加IGF2BP2多聚泛素化，提示其部分通过抑制泛素化相关降解稳定IGF2BP2，但具体E3泛素连接酶及其他翻译后修饰尚不明确，且未进行蛋白酶体挽救实验。circSMAD4与IGF2BP2高表达与侵袭性疾病及不良预后相关，但未行多变量Cox回归，其是否為独立预后因素待定。circBank数据显示circSMAD4组织表达异质且相对局限，以脑最高，但不足以确立GBC特异性，需泛癌分析。研究数据不支持circSMAD4高效翻译或作为经典Ago2依赖性微小RNA海绵，支持以蛋白互作为主的机制。与依赖m⁶A的YTHDC1不同，IGF2BP2对circSMAD4核输出的部分作用不依赖m⁶A识别基序，且IGF2BP2缺乏经典核定位信号，其入核机制未明。质谱候选中CTTN与RBM14等尚待进一步表征。CWI1-2在体内降低IGF2BP2丰度可能反映持续通路抑制的累积效应而非直接降解作用。研究揭示IGF2BP2作为circRNA生物生成上游调控者与下游效应器的双功能RBP特性，突显circSMAD4/IGF2BP2复合物作为GBC潜在治疗靶点。研究结论翻译：本研究将hsa_circ_0108590（circSMAD4）表征为胆囊癌中SMAD4来源的致癌circRNA。机制上，IGF2BP2以m⁶A依赖方式促进circSMAD4生物生成并有助于其稳定，而circSMAD4至少部分通过抑制泛素化相关降解反向稳定IGF2BP2。这种相互调控支持促进GBC进展的正反馈环。转录组富集与选定蛋白水平分析进一步表明该调控轴与JAK2/STAT3信号增强及EMT相关分子变化相关。此外，CWI1-2破坏circSMAD4-IGF2BP2互作并抑制异种移植模型中的肿瘤生长，为药理靶向该调控轴提供临床前概念验证。总之，研究揭示了GBC中此前未表征的circSMAD4-IGF2BP2调控机制，并突显m⁶A依赖性circRNA-RBP互作作为潜在治疗脆弱点。