FSP1作为自噬与泛素化交汇枢纽调控野百合碱诱导肺动脉高压中铁死亡的机制研究

《Clinical and Translational Medicine》：FSP1 as the convergent hub of autophagy and ubiquitination governing ferroptosis in monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension

　　

铁死亡抑制蛋白1（FSP1）被鉴定为连接肺动脉高压（PAH）中自噬与铁死亡的核心分子节点。机制上，FSP1的降解受到NBR1介导的自噬流与RNFT1驱动的K63连接泛素化的协同调控，共同加剧铁死亡及PAH进展。联合应用FSP1过表达与自噬抑制剂Apelin-13可通过稳定FSP1并抑制铁死亡，协同缓解大鼠PAH症状。本研究不仅揭示了调控FSP1稳定性的双通路机制，验证了靶向FSP1降解的新型治疗策略，同时为PAH的临床治疗提供了新颖的联合干预方案。

研究背景与现存问题

肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension, PAH）是一种以进行性肺血管重塑和肺血管阻力增加为特征的致死性疾病，其核心病理过程涉及肺血管细胞的异常收缩、过度增殖、凋亡抵抗及炎症反应。尽管现有血管扩张剂可部分缓解症状，但无法逆转疾病进展。近年来，铁死亡（ferroptosis），一种由过量脂质过氧化物积累驱动的铁依赖性调节性细胞死亡，已被确定为PAH发病机制中的关键放大器。自噬（autophagy）在PAH中的作用复杂且具有情境依赖性：适度的自噬可通过清除受损细胞器维持稳态，但在PAH慢性应激条件下，持续过度的自噬激活则通过降解关键细胞组分促进疾病进展。然而，自噬与铁死亡在PAH中的相互作用机制尚不明确。铁死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein 1, FSP1）是一个独立于经典谷胱甘肽-GPX4通路的关键铁死亡抑制因子，但其在PAH中的精确调控机制和功能意义仍不清楚。因此，阐明自噬异常激活与铁死亡之间的交互作用，特别是FSP1在这一过程中的角色，对于理解PAH的病理本质并开发新型治疗策略至关重要。

研究内容与结论

该研究旨在阐明FSP1作为连接自噬与铁死亡的中心分子节点的作用，并探索靶向FSP1降解的联合治疗策略。研究人员首先通过生物信息学分析发现，在自噬活跃的PAH样本中铁死亡更为显著，并鉴定出FSP1是连接自噬与铁死亡的关键分子。利用野百合碱（monocrotaline, MCT）诱导的大鼠PAH模型，研究发现Apelin-13（一种自噬抑制剂）可通过抑制病理性自噬、恢复FSP1丰度并减轻内皮细胞铁死亡，从而缓解PAH症状。进一步的体外细胞实验证实，自噬的药理学激活会加剧MCTP（MCT的活性代谢物）诱导的FSP1耗竭和铁死亡损伤，而抑制铁死亡或敲低FSP1并不反馈调节自噬通路，确立了“自噬→FSP1↓→铁死亡”的单向分子级联。机制上，研究揭示了FSP1稳定性受双重降解通路协同调控：选择性自噬受体NBR1识别并结合FSP1，将其转运至自溶酶体进行降解；同时，E3泛素连接酶RNFT1催化FSP1发生K63连接的泛素化，这一泛素标签作为NBR1的识别信号，最终将FSP1引导至自溶酶体降解。基于此机制，研究人员提出并验证了联合治疗策略：AAV介导的FSP1过表达联合Apelin-13给药，通过外源性补充FSP1并阻断其自噬降解，在大鼠模型中产生了协同保护效应，显著逆转了肺血管重塑、改善了血流动力学功能障碍并减轻了炎症损伤。

主要技术方法

研究采用了多种关键技术方法：利用公共数据库（GSE117261、GSE210248、GSE113439、GSE254617）进行批量RNA-seq和单细胞转录组分析；建立MCT诱导的Sprague–Dawley（SD）大鼠PAH模型进行体内药效评估；分离原代大鼠肺动脉内皮细胞（PAECs）和HEK-293T细胞进行体外机制研究；运用Western blot、免疫荧光、透射电子显微镜等技术检测自噬流和蛋白表达；采用C11-BODIPY 581/591探针、FerroOrange探针等生化方法评估铁死亡相关指标；通过免疫共沉淀（Co-IP）和泛素化实验分析蛋白质相互作用及翻译后修饰。

研究结果

3.1 FSP1是通过自噬激活介导铁死亡进而促进PAH发展的关键基因

通过对GSE117261数据集的分析，发现在自噬活跃的PAH样本中铁死亡更明显，两者呈正相关。单细胞转录组分析（GSE210248）证实FSP1编码基因AIFM2主要在肺内皮细胞群中表达，且在PAH病变的内皮细胞中其转录丰度和阳性细胞比例均显著降低。在MCT诱导的大鼠PAH模型中，Apelin-13处理可逆转肺小动脉中膜增厚、胶原沉积和管腔狭窄，改善血流动力学参数，抑制病理性自噬，恢复FSP1和辅酶Q10的丰度，并减轻铁死亡特征。

3.2 氯喹的药理自噬抑制逆转了MCTP诱导的FSP1下调、铁死亡激活和肺动脉内皮功能障碍

在原代PAECs中，MCTP处理时间依赖性地激活自噬流、破坏铁平衡并逐步加重铁死亡损伤。自噬抑制剂氯喹（chloroquine, CQ）可部分挽救MCTP导致的细胞活力下降，减少总活性氧和脂质过氧化物积累，阻断过度自噬，恢复FSP1表达，纠正铁代谢紊乱，并改善内皮功能标志物（eNOS、BMPR2）和粘附分子（ICAM-1、VCAM-1）的表达，同时抑制促炎细胞因子的分泌。

3.3 药理自噬激活加剧了MCTP诱导的PAECs中FSP1耗竭和铁死亡损伤

雷帕霉素（rapamycin, RAPA）作为自噬激动剂，进一步降低了MCTP处理后PAECs的存活率，增加了自噬体和自溶体数量，加剧了总ROS和脂质ROS积累，加重了铁超载、MDA升高和GSH耗竭，并进一步降低了FSP1蛋白水平。相反，铁死亡抑制剂Fer-1或shRNA介导的FSP1敲低并不影响核心自噬分子的活性，表明铁死亡执行或FSP1耗竭对自噬通路无反馈调节作用。

3.4 NBR1将FSP1转运至自溶酶体进行自噬降解

自噬激活导致FSP1蛋白水平下降但不影响其mRNA水平，自噬抑制剂可逆转这一现象。通过AlphaFold3分子对接筛选和免疫共沉淀验证，发现选择性自噬受体NBR1而非HDAC6是介导FSP1自噬降解的关键受体。NBR1通过与FSP1的直接相互作用，并在其UBA结构域（泛素结合域）的参与下，将FSP1递送至自溶酶体。敲低NBR1可抑制自噬介导的FSP1下调并增强其蛋白稳定性。

3.5 E3泛素连接酶RNFT1介导FSP1的泛素化和降解

通过整合多组学数据筛选，鉴定出E3泛素连接酶RNFT1是FSP1的潜在相互作用蛋白。Co-IP证实了FSP1与RNFT1的特异性结合。RNFT1以依赖于其E3连接酶活性的方式促进FSP1的K63连接多聚泛素化。自噬激活增强了FSP1与RNFT1的相互作用，而RNFT1过表达则可逆转由NBR1敲低引起的FSP1积累，并同时增强FSP1与NBR1的结合，表明RNFT1介导的泛素化和NBR1介导的选择性自噬协同调控FSP1的降解。

3.6 氯喹通过稳定FSP1蛋白减轻MCT诱导的PAEC损伤

CQ处理在不影响FSP1 mRNA水平的情况下，剂量依赖性地增加FSP1蛋白表达。机制上，CQ通过抑制FSP1的K63连接多聚泛素化及其后续的蛋白酶体降解来增强FSP1稳定性。CQ还能拮抗NBR1过表达介导的FSP1下调，并减少FSP1与NBR1的结合。

3.7 FSP1过表达与Apelin-13联合疗法减轻大鼠PAH进展

AAV介导的FSP1过表达单药治疗可部分缓解MCT诱导的PAH，而联合Apelin-13给药则产生协同保护作用。联合治疗更有效地恢复了FSP1丰度，纠正了铁失衡，减轻了铁死亡标志物，抑制了过度自噬，恢复了内皮保护蛋白（eNOS、BMPR2）表达，下调了粘附分子，并减轻了血管炎症，且未观察到明显的肝、脾、肾毒性。

讨论与结论

讨论部分指出，该研究首次将FSP1确立为连接PAH中自噬与铁死亡的中心分子节点，揭示了其蛋白稳定性受NBR1介导的自噬降解和RNFT1介导的泛素化双重通路协同调控的精细网络。这一发现将研究范式从将自噬和铁死亡视为平行事件转变为理解它们通过特定蛋白节点进行的直接串扰。基于此机制提出的FSP1过表达联合Apelin-13的联合治疗策略，通过双重层面干预（阻断泛素-自噬降解和外源性补充功能性FSP1），在动物模型中显示出显著的协同疗效。研究还讨论了潜在的临床转化价值，包括该策略对不同PAH亚型的适用性、Apelin-13作为低毒内源性肽的优势，以及该治疗范式向其他心血管和纤维化疾病的扩展潜力。同时，也客观指出了临床转化的瓶颈，如AAV载体肺内皮趋向性不足、长期自噬抑制的心血管安全性风险以及缺乏患者分层生物标志物等问题。此外，讨论还展望了基于该调控轴进行PROTAC药物开发的可行性。

研究结论

研究人员证明FSP1是连接自噬和铁死亡的关键分子，其下调是PAH进展的关键驱动因素。机制上，FSP1蛋白稳定性受双重降解通路协同调控：自噬受体NBR1识别并结合FSP1，通过LC3介导的自噬途径将其转运至自溶酶体降解；与此同时，E3泛素连接酶RNFT1介导FSP1的K63连接多聚泛素化，该泛素标签作为自噬受体NBR1的识别信号，最终将FSP1引导进入自溶酶体进行溶酶体降解。这些通路共同构成了控制FSP1稳定性的精密调控网络。本研究不仅阐明了自噬-泛素串扰调控FSP1稳定性进而影响铁死亡的新机制，而且提出了靶向FSP1降解治疗PAH的新治疗理念，为未来的转化研究奠定了关键理论基础。