《Journal of Radiation Research and Applied Sciences》：Thrombospondin-1 suppresses HBV replication via modulating antiviral immunity and macrophage polarization
编辑推荐：
目的：慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是持续存在的全球健康威胁，高度易导致个体发生肝硬化和肝细胞癌（HCC）。尽管THBS1因其免疫调节特性而被认识，但其在HBV致病过程及后续肝病中的作用尚未完全阐明。方法：在HBV感染免疫清除期患者中测定循环THBS1水平。血
目的：慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是持续存在的全球健康威胁，高度易导致个体发生肝硬化和肝细胞癌（HCC）。尽管THBS1因其免疫调节特性而被认识，但其在HBV致病过程及后续肝病中的作用尚未完全阐明。方法：在HBV感染免疫清除期患者中测定循环THBS1水平。血清分析纳入21例健康对照和59例HBV患者，覆盖预设的各分期。在公共HCC数据集中分析THBS1表达及其与免疫细胞浸润的相关性。体外实验采用Huh7/HepG2 HBV复制模型和THP-1来源巨噬细胞评估THBS1对M1样巨噬细胞极化的影响。此外，采用强制表达THBS1的HBV复制小鼠模型（每组n=10）进行体内实验，以评估其对肝脏HBV复制的影响。结果：初步研究显示，处于HBV感染免疫清除期的患者循环THBS1水平显著升高。尽管THBS1在HCC组织中总体呈下调表达，但其表达与免疫细胞浸润程度呈正相关，提示其具有复杂的功能双重性。在功能上，THBS1敲低可降低体外M1样标志物。最重要的是，在HBV复制小鼠模型中，强制表达THBS1与肝脏HBV复制减少相关。结论：总体而言，研究人员的发现表明THBS1在抗病毒应答过程中被诱导，与M1样极化相关，并在工程化过表达模型中具有抗病毒效应。这种分期依赖性作用使THBS1成为需要在HBV相关肝病中进一步验证的候选通路。
慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是全球重大公共卫生问题，尽管预防性疫苗已应用数十年，现有核苷（酸）类似物（NAs）虽能持久抑制病毒复制，但功能性治愈仍不常见，彻底清除持续性病毒模板难以常规实现。宿主天然免疫在控制HBV中发挥关键作用，巨噬细胞尤其是肝脏驻留Kupffer细胞及循环单核细胞来源巨噬细胞，通过释放促炎介质（TNF-α、IL-6、IL-1β）、趋化因子及I型干扰素参与抗病毒防御，但慢性感染中持续巨噬细胞活化可导致过度炎症、肝损伤及纤维化。血小板反应蛋白-1（THBS1/TSP1）是一种分泌型糖蛋白，具有细胞黏附、血管生成、免疫调节等多效生物学活性，既往研究提示其参与肝脏脂肪变性、肝纤维化及慢加急性肝衰竭等病理过程，且与巨噬细胞极化调控相关，但THBS1在HBV致病机制中尤其是与巨噬细胞相互作用的确切贡献尚不清楚。为此，研究人员开展系列实验，目的包括：量化不同免疫分期HBV携带者循环THBS1水平；评估公共TCGA-LIHC和GEO数据集中THBS1表达及其与免疫细胞浸润关系；检查THBS1调控在HBV复制或HBV基因组表达肝癌细胞中的功能后果；评估THBS1是否影响HBV复制小鼠模型中的天然抗病毒应答及M1样巨噬细胞极化。研究结论表明，THBS1在抗病毒免疫清除期被诱导，与M1样巨噬细胞极化相关，并在工程化过表达模型中与HBV相关读数降低相关；在HCC数据集中THBS1表达与独特免疫和基质特征相关，但其在肿瘤免疫逃逸中的主动促进或抑制作用尚未解决，THBS1的治疗相关性需在生理代表性HBV模型中结合正式疗效与安全性研究加以验证。
研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：临床队列血清样本（健康对照21例、免疫耐受/慢性感染期38例、免疫活跃/清除期21例，2022年3月至2024年10月招募）ELISA检测；公共HCC数据集（TCGA-LIHC、GSE94660、GSE121248）生物信息学分析及TIMER2.0免疫浸润分析；Huh7/HepG2细胞HBV复制模型（1.3倍HBV基因组导入）与THP-1来源巨噬细胞体外实验；慢病毒介导THBS1过表达（THBS1 OE）与shRNA敲低；数字PCR（dPCR）定量HBV DNA拷贝数；qPCR、Western blot及ELISA检测；rAAV8-1.3HBV HBV复制C57BL/6小鼠模型（每组10只，设Vector、Vector+1.3HBV、THBS1 OE+1.3HBV、THBS1 OE+1.3HBV+TAK-242四组）及TLR4抑制剂TAK-242干预。
3.1 乙型肝炎血清与HCC组织中THBS1的差异表达：通过ELISA检测发现，健康个体与免疫耐受期HBV患者循环THBS1水平相当，但免疫清除期患者血清THBS1显著升高，同时循环IL-1β、IL-6、TNF-α亦升高；通过TCGA-LIHC、GSE94660、GSE121248生物信息学分析显示，HCC组织中THBS1表达较癌旁非癌肝组织显著下调，提示THBS1在HBV感染中呈分期依赖性调控并在HCC中差异表达。
3.2 THBS1表达与HCC免疫浸润相关：通过生物信息学分析发现，THBS1表达与B细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞及树突状细胞浸润正相关；Kaplan-Meier生存分析显示THBS1表达与HCC患者总生存无显著相关；按THBS1中位表达分层后，THBS1高表达亚组ESTIMATE、免疫及基质评分显著升高、肿瘤纯度降低，免疫检查点基因（如CD274/PD-L1、CTLA4）及抗原提呈基因（如HLA-A、HLA-B）显著上调，该亚组肿瘤突变负荷（TMB）较低但TP53、CTNNB1等驱动基因突变频率较高，药物敏感性分析预测其对Staurosporine、Dasatinib及多种CDK9抑制剂更敏感，提示THBS1在肝癌发生中总体下调，但部分肿瘤中维持或再诱导表达与独特免疫基质特征相关。
3.3 THBS1过表达增强Huh7和HepG2细胞暴露于HBV时的抗病毒免疫：通过dPCR和ELISA确认HBV转染有效并显示强制THBS1表达与HBV相关读数降低相关；qPCR显示HBV复制抑制Huh7和HepG2细胞内源性THBS1表达，而THBS1过表达可恢复并升高其水平；Western blot显示被HBV复制抑制的抗病毒蛋白MX1、ISG15、OAS1在THBS1过表达后显著增强。
3.4 THBS1促进THP-1来源巨噬细胞M1样极化：通过Western blot确认PMA强诱导THP-1细胞巨噬细胞标志物CD68及LPS+IFN-γ协同诱导M1极化标志物CD86上调；qPCR筛选出敲低效率最高的shTHBS1-3用于后续实验；Western blot证实THBS1敲低降低M1样炎症表型标志物CD86、iNOS及促炎因子，ELISA显示THBS1敲低后M1极化THP-1细胞分泌TNF-α、IL-6、IL-1β降低，表明THBS1与THP-1细胞M1样极化相关并促进促炎免疫应答。
3.5 THBS1在HBV复制小鼠模型中调控抗病毒免疫与巨噬细胞极化：通过dPCR和ELISA显示小鼠模型中THBS1过表达与HBV相关病毒读数显著降低相关，并增强TNF-α、IL-6、IL-1β分泌；Western blot证实THBS1过表达小鼠肝组织中受HBV复制抑制的抗病毒蛋白ISG15、MX1、OAS1显著上调，HBV复制强抑制THBS1表达并降低M1样标志物（iNOS、CD86）、增加M2样标志物（CD206），而THBS1过表达可逆转这些效应；通过TLR4抑制剂TAK-242处理显示其消除THBS1对HBV复制的抑制作用、减少促炎因子分泌、降低M1样标志物并增加CD206、降低THBS1及ISG15、MX1、OAS1水平，提示THBS1在体内与抑制HBV复制相关且伴随M1样巨噬细胞标志物增加。
讨论部分总结：研究人员指出尽管有效预防性疫苗存在数十年，慢性HBV感染仍为全球重大健康问题，当前治疗不能治愈，亟需新治疗策略。研究揭示THBS1在体外和体内模型中的关键抗HBV作用，强调其作为乙型肝炎治疗潜在靶点的前景。研究显示血清THBS1浓度在HBV感染过程中呈分期依赖性波动，免疫耐受期与健康对照无差异而免疫清除期显著升高；因THBS1富集于血小板α颗粒且凝血时可释放，血小板来源THBS1是血清检测的潜在混杂因素，本研究未用贫血小板血浆验证，应在未来工作中考虑。HBV影响THBS1表达的精确机制尚不完全清楚，一种可能是免疫耐受期高水平HBV复制抑制THBS1表达而免疫清除期病毒复制降低解除抑制；体外肝癌细胞系中HBV对THBS1的抑制与患者免疫耐受期表达未改变之间的表观差异提示体内THBS1调控可能更复杂，可能涉及体外培养系统缺失的免疫微环境补偿信号。支持该假设的是HBV可上调靶向THBS1的miR-222-3p促进HCC发生，这与生物信息学分析中THBS1在HCC组织下调一致；或者免疫清除期免疫系统活化可直接增强THBS1表达，需进一步研究。尽管THBS1在HCC组织中表达降低，生存分析未显示THBS1水平与HCC患者预后显著相关，但THBS1表达与多种免疫细胞浸润正相关；M1样巨噬细胞浸润减少与HCC患者预后不良相关，而THBS1促进M1样极化，因此较高THBS1表达可能有助于改善生存结局，其预后价值需更大队列进一步研究；考虑到免疫浸润在HCC中的复杂作用，也可能THBS1对HCC肿瘤发生并非必需，其精确作用需未来深入研究以明确其作为治疗靶点或预后生物标志物的潜力。生物信息学分析显示THBS1表达与免疫细胞浸润正相关但表达水平与HCC患者生存无显著关联，这一矛盾发现提示THBS1在HCC中的功能复杂性；亚组分析显示高THBS1表达定义了一种独特HCC亚型，以免疫浸润丰富伴免疫抑制特征为特点，包括M2样巨噬细胞和调节性T细胞增加、CD8+ T细胞减少及免疫检查点分子上调；这些观察基于横断面转录组数据，不能确定THBS1在塑造免疫抑制肿瘤微环境中的因果作用；因公共HCC数据集病因异质且HBV状态未统一标注，这些关联并非HBV相关HCC特异，未来需有明确HBV状态的研究确定THBS1表达在HBV阳性和阴性HCC间是否存在差异；突变频率和计算机药物敏感性发现为探索性，需独立验证，数据衍生生存阈值除非外部验证应谨慎解释。THBS1通过与特定细胞表面受体相互作用调节多种免疫细胞功能；研究发现过量THBS1与THP-1来源巨噬细胞及暴露于HBV的C57BL/6小鼠中M1样极化相关，提示其促M1样极化效应在不同情境中保守；因TAK-242并非巨噬细胞或M1特异，TAK-242对THBS1相关表型的衰减不能确立巨噬细胞特异性因果关系，肝细胞内在和巨噬细胞相关效应可能代表平行机制；此外TAK-242应用降低HBV暴露小鼠肝脏THBS1表达，可能由于其抑制表达高水平THBS1的M1样巨噬细胞，该降低是否对TAK-242特异或为M1极化抑制剂的一般效应尚待确定；THBS1的治疗性增强应谨慎考虑，因THBS1在肝脏中具有情境依赖性促炎和促纤维化活性。本研究局限性包括：临床队列相对较小且HBV分期分类依赖回顾性记录的临床标准，血小板计数未统一可得且血小板来源THBS1是血清检测潜在混杂因素，未用贫血小板血浆验证；肝癌来源复制系统不能重现自然HBV进入、持续存在、天然感应及分化肝细胞生物学的全部特征，肝细胞发现应视为机制性概念验证；未在HBV复制肝癌细胞中进行反向THBS1敲低及在巨噬细胞中进行THBS1过表达，未在多个连续时间点测量HBV滴度及HBV相关抗体；尽管THBS1似乎为M1样巨噬细胞极化所必需，其精确机制仍不清楚，关于"抗病毒免疫"和"M1样巨噬细胞极化"的结论主要基于表型和相关性分析，需流式细胞术或免疫染色定义巨噬细胞群体及上游IFN/JAK-STAT通路分析强化机制结论；因THBS1为分泌型基质细胞蛋白，当前遗传学实验不能区分细胞外受体介导信号与THBS1表达改变的细胞内或继发后果，需条件培养基、重组THBS1、细胞外中和及受体特异性干预确定生物学活性 compartment；需更靶向方法如氯膦酸盐脂质体巨噬细胞清除确认THBS1是否主要经巨噬细胞发挥作用；体内实验使用C57BL/6小鼠免疫健全模型支持rAAV8-1.3HBV介导的HBV复制，但该模型反映AAV介导的HBV基因组表达和复制而非自然HBV感染，宿主免疫应答可能与慢性HBV患者不同；需更大临床队列和动物模型验证THBS1作为治疗靶点或生物标志物的潜力；尽管THBS1过表达与HBV相关读数降低相关，但也增加循环促炎因子，因未全面评估肝损伤、生化肝毒性及组织病理学结局，本研究不能确定抗病毒表型是否转化为净肝脏获益。
研究结论翻译：总之，研究人员的发现确定THBS1为HBV相关抗病毒及巨噬细胞应答的候选调节因子。在抗病毒免疫清除期，THBS1被诱导并与M1样巨噬细胞极化及工程化过表达模型中HBV相关读数降低相关。在HCC数据集中，THBS1表达与独特免疫和基质特征相关，但THBS1主动促进还是抑制肿瘤免疫逃逸仍未解决。THBS1的治疗相关性需在生理代表性HBV模型中结合正式疗效和安全性研究加以验证。
