对组装真菌金属载体fusarinine C的生物合成机制的结构学研究

《Journal of Structural Biology》：Structural investigations into the biosynthetic machinery which assembles the fungal metallophore fusarinine C

　　

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  尺寸排阻色谱法和分析超速离心研究结果表明，非核糖体肽合成酶SidD在溶液中以二聚体形式存在。
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  冷冻电镜（cryoEM）和X射线晶体学分析发现了一种由退化腺苷酰化结构域形成的新的二聚体界面。
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  对SidH活性位点的晶体结构研究以及底物建模表明，该酶将甲羟戊酸-CoA脱氢化为顺式-无水甲羟戊酸-CoA，而非更稳定的反式异构体。

引言

非核糖体肽合成酶（NRPS）是一类模块化的大分子酶，能够生物合成二次代谢产物，为宿主微生物提供优势（Fischbach和Walsh，2006年）。其中一些分子可作为药物造福人类（Agrawal等人，2017年；Newman和Cragg，2012年）。NRPS通常由多个功能结构域组成，每个结构域称为一个模块，共同参与将一个酰基单体引入正在增长的肽链中（Reimer等人，2018年）：腺苷酰化（A）结构域通过腺苷酰化激活相应的单体，然后将其连接转移到转移（或硫醇化；T）结构域的磷泛硫氨酸臂（ppant）上（Gulick等人，2003年）。T结构域随后将氨基酰基传递到缩合（C）结构域，与上游T结构域连接的肽基中间体形成肽键（Bloudoff和Schmeing，2017年；Schwarzer等人，2003年）。不断增长的肽链在每个模块中依次延长，最终由终止结构域释放（Horsman等人，2015年；Wang等人，2009年）。

成熟的非核糖体肽中包含超过500个残基，其中包括不常见的氨基酸、芳基酸、羟基酸和脂肪酸（Blin等人，2023年）。NRPS使用的单体底物远超出20种常见的蛋白质氨基酸，它们可以从初级代谢过程中获取分子，或者由NRPS基因簇中的酶合成特殊的单体。此外，NRPS在将残基引入肽链的过程中可以进行化学修饰，而在肽链释放后，专门的酶也可以对其进行修饰。

某些NRPS，尤其是真菌中的NRPS，具有非典型特征（Gao等人，2012年；Hai等人，2020年；Jenner等人，2023年；Lee等人，2010年；Witte等人，2025年）。这些特征包括单个模块的重复使用，以及缺乏A结构域的模块的存在；在真菌NRPS中，末端缩合和环化结构域比细菌NRPS更为常见。真菌NRPS的非典型特征常见于产生金属载体的系统中（Haas，2014年；Happacher等人，2023年）。由于可溶性铁是生长限制因素，真菌需要螯合铁的分子来清除不溶性的Fe³⁺。小分子金属载体对烟曲霉在人体内的致病性至关重要（Schrettl等人，2004年；Tekaia和Latge，2005年）。金属载体fusarinine C是一种环状的非核糖体肽，由三个顺式-N⁵-无水甲羟戊酸-N⁵-L-羟基鸟氨酸（顺式-AMHO）单元组成。这种顺式-AMHO是由四个酶级联反应产生的（图1）：SidA从初级代谢途径中获取L-鸟氨酸并将其羟基化（Mei等人，1993年）。同时，SidI将（3R）-甲羟戊酸和CoA缩合为（3R）-甲羟戊酸-CoA。SidH将其脱水生成顺式-无水甲羟戊酸-CoA（Yasmin等人，2012年）。其配置较为特殊，因为反式异构体更为稳定。最后，顺式-无水甲羟戊酸-CoA与N⁵-L-羟基鸟氨酸通过SidF缩合生成顺式-AMHO（Schrettl等人，2007年）。

顺式-AMHO通过非典型的NRPS SidD组装成三聚体环状肽（补充图S1）。SidD具有独特的结构域组成（图1），包括一个A-T起始模块、两个具有正常C和T结构域的模块（分别位于一个缩短的A结构域两侧），以及一个末端的真菌C结构域（即：A₁T₁C₂A₂*T₂C_term3）。Tang及其同事进行了精细的生化研究，证明SidD利用A₁将顺式-AMHO加载到两个T结构域中，并发现A₂*没有催化活性（Hai等人，2020年）。加载T结构域后，SidD利用C₂结构域在两个顺式-AMHO分子之间形成酯键。然后A₁再重新加载一个T结构域，由C₂结构域进行第二次缩合并形成三肽。第二次缩合的具体机制尚不清楚，有两种可能的途径：“路径1”中，T₁在第一次缩合后释放顺式-AMHO，随后再次被顺式-AMHO加载，并在第二次缩合中作为受体，接受来自供体T₂的di-(顺式-AMHO）。这种机制较为特殊，因为它要求每个T结构域同时结合同一C结构域的供体和受体位点。“路径2”中，T₂上的di-(顺式-AMHO)中间体被转移到T₁，然后T₂被重新加载顺式-AMHO，再与供体di-(顺式-AMHO)-T₁和受体顺式-AMHO-T₂发生缩合（Hai等人，2020年）。这种方法只涉及常规的缩合反应，但C结构域的返传机制尚无先例。无论哪种途径，最终形成的三肽都会被末端的C_term3结构域环化并释放（Gao等人，2012年；Hai等人，2020年）。

本文报告了Sid途径的X射线晶体学和冷冻电镜研究结果。SidD二聚体的结构以及SidH和SidF中底物的结构建模加深了我们对金属载体合成过程和真菌NRPS非典型特征的理解。

章节摘要

SidD通过一种新发现的二聚化机制形成二聚体

讨论

SidD似乎是研究真菌NRPS非典型特征的理想模型系统，因为这个完整的、规模适中的NRPS系统仅以单一蛋白质的形式存在。我们仅能够计算出SidD的一个片段T₁C₂A_rem2的可解释结构图（图2）。其余结构域（A₁和A_sub2T₂C_term3）要么变化太大而无法对齐，要么在空气-水界面展开，或者两者兼而有之。已知NRPS具有极高的灵活性，尤其是在

结论

分子克隆

使用引物Cther SidD Fwd和Cther SidD Rev（补充表S3）从基因组DNA中扩增了Cther SidD（XP_006694387），并通过Gibson组装方法（Gibson等人，2009年）将其克隆到定制的细菌表达载体中。Afum SidD（XP_748662.1）由UCLA的Yi Tang实验室提供。Afum SidH（XP_748661.1）和SidF（XP_748660.1）以及Afum和Cthe A_rem由Bio Basic公司合成，并亚克隆到基于pET的表达载体中。

CRediT作者贡献声明

Elias Kalthoff：撰写——初稿，可视化，方法学，研究，形式分析，概念化。Michael J. Tarry：撰写——审阅与编辑，可视化，方法学，研究，形式分析。Anirudh Mantri：撰写——审阅与编辑，可视化，验证，方法学，研究，形式分析。Nadja S. Finkel：研究，形式分析。Angelos Pistofidis：形式分析。Frederik T. Hansen：方法学，形式分析，概念化。

Krissinel和Henrick，2007

Mei等人，2025

Meng等人，2023

Scheres，2012

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能会影响本文的研究结果。