《Chemical Biology & Drug Design》：Machine Learning-Guided Discovery of Novel Inhibitors of Escherichia coliMurB
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MurB是参与细菌细胞壁生物合成的关键酶，是抗菌药物发现的重要靶点。本研究采用机器学习方法鉴定靶向大肠杆菌MurB的潜在抑制剂。研究人员利用AutoMolDesigner构建了五种机器学习模型，其中基于RDKit_2D的Model_2被选为最优活性预测模型，用
MurB是参与细菌细胞壁生物合成的关键酶，是抗菌药物发现的重要靶点。本研究采用机器学习方法鉴定靶向大肠杆菌MurB的潜在抑制剂。研究人员利用AutoMolDesigner构建了五种机器学习模型，其中基于RDKit_2D的Model_2被选为最优活性预测模型，用于对内部化合物库进行虚拟筛选，获得238个化合物。这些化合物随后经FRED分子对接，基于与关键活性位点残基ASN A:233的氢键相互作用筛选出16个候选化合物。在50 μM浓度下进行的初步酶抑制实验鉴定出4个化合物（Q9、Q11、Q12和Q13），其抑制率超过50%。进一步测定IC??值分别为34.44、31.45、25.08和25.94 μM。研究人员采用分子动力学模拟结合主成分分析研究了MurB-配体复合物的动态行为与结合稳定性。此外，在HepG2细胞中进行了CCK-8实验以初步评估活性化合物的细胞毒性。综上，本研究鉴定出4个低细胞毒性的微摩尔级MurB抑制剂，为进一步的机制研究和结构优化提供了有前景的骨架。
**研究背景与问题**
细菌感染仍然是全球主要死亡原因之一。2019年，与细菌感染相关的疾病导致约770万人死亡，占全球总死亡人数的13.6%。大肠杆菌（Escherichia coli）是最常见的革兰氏阴性病原体之一，可引起尿路感染、血流感染和腹腔感染等多种感染。耐抗生素大肠杆菌菌株的不断增加对现有治疗方案构成了重大挑战。因此，鉴定新型抗菌靶点并开发针对大肠杆菌的新型抑制剂具有重要的临床和科学意义。
细菌细胞壁对维持细胞完整性、促进生长和确保存活至关重要，常被用作抗菌研究的靶点。肽聚糖（PG）是细菌细胞壁的主要结构成分，约占其干重的50%–80%，在维持机械强度和形态稳定性方面发挥关键作用。PG生物合成是一个高度保守且复杂的过程，涉及约20个酶促反应。根据这些反应的亚细胞定位，生物合成途径可分为三个阶段：细胞质阶段、膜相关阶段和胞外阶段。每个阶段涉及多个必需酶，这些酶已被广泛认为是抗菌药物开发的有吸引力的靶点。
MurB是参与PG生物合成早期阶段的关键细胞质酶。它催化NADPH依赖的UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮酸（UNAGEP）还原为UDP-N-乙酰胞壁酸（UDP-MurNAc），后者是细菌细胞壁组装的重要前体。由于该反应对于生成细菌细胞壁基本构件不可或缺，抑制MurB可有效破坏PG生物合成，导致细胞壁形成受损并抑制细菌生长。因此，MurB已被认为是一个极具前景的抗菌靶点，深入研究该酶可能为对抗细菌感染提供新策略。
迄今为止，尚无MurB特异性抑制剂被批准用于临床，相关研究仍处于早期探索阶段。已报道的MurB抑制剂数量有限，大致可分为几个化学类别，包括4-噻唑烷酮衍生物、咪唑啉酮衍生物、吡唑烷二酮类似物和苯基噻唑基脲化合物。尽管这些化合物在体外对MurB表现出可测量的抑制活性，但其结构多样性、抗菌效力、类药性和安全性仍需进一步优化。这些局限性凸显了持续进行系统筛选和机制研究以鉴定新型MurB抑制剂骨架的必要性。
机器学习是一种数据驱动的方法，已越来越多地应用于药物发现和开发。AutoMolDesigner是一种计算软件工具，集成了基于自动机器学习的活性和性质预测。在本研究中，研究人员使用AutoMolDesigner（1.1版）构建了五种机器学习模型，随后选择预测性能最佳的模型筛选内部化合物库。虚拟筛选是一种从大型化学库中优先筛选潜在活性化合物的计算策略。因此，预测的候选化合物通过分子对接进一步评估，特别关注其与MurB活性位点关键催化残基的相互作用。随后进行分子聚类以降低结构冗余并选择代表性化合物进行进一步实验评估。
通过机器学习虚拟筛选鉴定的化合物随后被评估对重组大肠杆菌MurB的抑制活性，最终鉴定出四个活性化合物Q9、Q11、Q12和Q13。随后评估了其细胞毒性。为进一步表征这些活性化合物，进行了密度泛函理论（DFT）计算以研究其电子性质和分子静电势分布。随后进行分子动力学（MD）模拟以研究活性化合物在MurB结合位点内的稳定性和相互作用模式。进一步进行主成分分析（PCA）以表征蛋白质-配体复合物的主要构象运动，同时使用MM-GBSA计算估计其结合自由能。
**关键技术方法**
本研究采用的主要技术方法包括：（1）从ChEMBL数据库收集112个大肠杆菌MurB靶向抑制剂，经预处理后保留84个独特抑制剂用于模型构建；（2）利用AutoMolDesigner的AutoGluon模块基于五种分子指纹/描述符（RDKit_2D_Norm、RDKit_2D、ECFP_4、FCFP_6和MACCS）构建五种分类模型；（3）使用FRED模块进行分子对接，以共结晶配体的原子坐标中心为对接中心，活性位点半径为8 ?；（4）使用ORCA 6.0.1在B3LYP/6-31G(d,p)水平进行DFT计算；（5）使用Schr?dinger软件套件中的Desmond模块进行MD模拟；（6）使用Prime MM-GBSA模块进行结合自由能计算；（7）使用R语言中的Bio3D包进行PCA分析；（8）体外酶抑制实验采用NADPH依赖性还原反应在340 nm处监测吸光度变化；（9）采用CCK-8法评估HepG2细胞毒性。内部化合物库包含16,828个化合物，包括Specs库的商业可得化合物、ChemDiv库的高通量筛选化合物以及实验室合成的化合物。
**研究结果**
**虚拟筛选**
数据集构建：从ChEMBL数据库检索到112个靶向大肠杆菌MurB的抑制剂，经AutoMolDesigner的"数据准备"模块预处理（标准化分子结构、去除盐、消除重复）后，保留84个独特抑制剂用于后续分析。
模型构建与评估：84个MurB抑制剂按80%训练集和20%测试集随机划分。基于五种分子指纹/描述符构建了五种分类模型。根据预设标准（MCC > 0.5且AUROC > 0.7），基于ECFP_4的Model_3和基于MACCS的Model_5因MCC值过低被排除，基于FCFP_6的Model_4因AUROC不足被排除。基于RDKit_2D_Norm的Model_1和基于RDKit_2D的Model_2均满足评价标准，其中Model_2表现更优。因此，选择基于RDKit_2D的Model_2用于后续虚拟筛选。
分子对接：筛选流程结合了基于RDKit_2D的Model_2的机器学习过滤、FRED分子对接、配体结合构象的视觉检查以及基于FCFP_6指纹的聚类以确保结构多样性。使用Model_2从内部库中鉴定出238个预测活性评分> 0.5的化合物。大肠杆菌MurB晶体结构（PDB: 2Q85）的结构分析表明活性配体与ASN A:233形成氢键。仅保留维持该相互作用的化合物。基于FCFP_6的聚类产生16个代表性簇。根据预测活性、低FRED ChemGauss4对接评分和合成可行性对化合物进行优先级排序，最终选择16个化合物进行实验验证。PubChem检索证实这些化合物此前未被报道为MurB抑制剂。
**活性化合物鉴定**
重组质粒pET-28b-MurB被合成并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行MurB蛋白表达。SDS-PAGE分析显示清晰条带，证实纯化成功。16个候选化合物在50 μM浓度下评估MurB抑制活性。Q9、Q11、Q12和Q13被鉴定为活性抑制剂，抑制率分别为60.30%、52.23%、65.68%和59.05%。虚拟筛选的实验命中率为25%。剂量-效应分析得到IC??值分别为34.44 ± 3.20 μM（Q9）、31.45 ± 3.44 μM（Q11）、25.08 ± 1.45 μM（Q12）和25.94 ± 0.87 μM（Q13）。
研究人员进一步评估了Q9、Q11、Q12和Q13对大肠杆菌ATCC 25922的抗菌活性，四个化合物的MIC值均大于64 μg/mL。尽管对重组MurB具有抑制活性，但四个化合物均未表现出明显的抗菌活性。酶学MurB抑制与全细胞抗菌活性之间的差异在其他MurB抑制剂中也有报道。Yang等人报道了一系列抑制大肠杆菌MurB但对野生型大肠杆菌无活性的3,5-二氧代吡唑烷类化合物。为测试外膜通透性的作用，作者进一步评估了这些化合物对增加外膜通透性的大肠杆菌K-12 imp菌株的活性，然而仅一个化合物对该菌株表现出活性，表明仅增加外膜通透性可能不足以恢复全细胞活性。在另一项研究中，Gilbert等人报道了一系列对大肠杆菌MurB具有低微摩尔抑制活性的5-羟基-1H-吡唑-3(2H)-酮衍生物，其构效关系分析表明MurB抑制效力和MIC值的改善与C-4取代基亲脂性的增加相关。这些发现表明结构特征、MurB抑制效力和全细胞抗菌活性之间的关系值得进一步研究。
**细胞毒性评价**
为评估化合物的细胞毒性，采用CCK-8法测定了经Q9、Q11、Q12和Q13（0.1–100 μM）处理的HepG2细胞活力。大多数化合物在浓度高达33 μM时表现出有限的细胞毒性效应。Q9在整个测试浓度范围内细胞活力保持在80%以上。Q13同样表现出良好的细胞相容性，在33 μM时细胞活力维持在80%以上。Q11引起浓度依赖性的细胞活力下降，但即使在最高测试浓度（100 μM）下活力仍保持在约60%以上。Q12在33 μM时对细胞活力影响有限，而在最高测试浓度（100 μM）时观察到细胞活力下降。综上，所评估的MurB抑制剂在HepG2细胞中表现出相对较低的细胞毒性。
**密度泛函理论计算**
DFT计算表征了Q9、Q11、Q12和Q13的电子结构。四个化合物在B3LYP/6-31G(d,p)水平使用ORCA 6.0.1完全优化，随后进行谐振频率计算。所有优化结构均未观察到虚频，证实优化几何构型对应于局部极小值。Q11具有最高的HOMO能量（?5.5067 eV）和最低的LUMO能量（?1.7520 eV），给出最小的HOMO–LUMO能隙（3.7547 eV）。Q12的HOMO和LUMO能量分别为?5.6498和?1.4518 eV，ΔE为4.1980 eV。Q9的HOMO和LUMO能量分别为?5.6312和?0.9894 eV，ΔE为4.6418 eV。Q13表现出最低的HOMO能量（?5.9427 eV）和LUMO能量?1.2682 eV，导致最大的ΔE（4.6745 eV）。HOMO–LUMO能隙顺序为Q11 < Q12 < Q9 < Q13。MEP分布显示Q9在共轭骨架区域呈现明显的负电势区域，而相对正电势集中在含氧部分。Q11表现出最显著的负正电势分离。Q12显示更局域化的静电模式。Q13在共轭骨架的富电子部分显示负电势，而相对正电势与含氧部分相关。
**分子动力学模拟的合理结合模式**
为研究不同配体在大肠杆菌MurB活性位点中的结合稳定性和动态行为，对MurB-共结晶配体复合物和Q9、Q11、Q12、Q13-MurB复合物进行了100 ns MD模拟。共结晶配体复合物作为参照。共结晶配体的羰基氧与TYR125形成氢键相互作用，其芳香环系统与TYR254建立π-π堆积相互作用。
Q9-MurB复合物在初始模拟阶段（0–5 ns）显示适度波动，约60 ns后逐渐稳定。整个模拟期间未观察到明显的结构漂移或配体解离。二维相互作用分析表明Q9的乙酰胺部分的羰基氧与SER229形成氢键相互作用，其芳香环系统与TYR125和TYR254建立π-π堆积相互作用。与TYR254的相互作用与共结晶配体中观察到的芳香识别特征一致。
Q11-MurB复合物在前50 ns显示较大波动，表明相比Q9更长的构象适应过程，但50 ns后RMSD逐渐稳定。Q11的羰基氧与GLY123形成氢键相互作用，其芳香环系统与TYR125建立π-π堆积相互作用。
Q12-MurB复合物在初始平衡阶段（0–10 ns）显示轻微波动，随后保持稳定。Q12的羰基氧与TYR125形成氢键相互作用，其芳香环系统与TYR254建立π-π堆积相互作用。与TYR254的保守π-π堆积相互作用表明Q12保留了与共结晶配体相似的芳香识别特征。
Q13-MurB复合物在达到稳定平衡状态前经历初始构象调整。Q13的羰基氧与ASN233形成氢键相互作用，其芳香环系统与TYR125建立π-π堆积相互作用。值得注意的是，Q13的羰基氧与ASN233之间的氢键相互作用与分子对接预测的关键相互作用一致，该相互作用在MD模拟中的持续性进一步支持了对接筛选策略的可靠性。
总体而言，MD模拟表明共结晶配体和Q9、Q11、Q12、Q13均能在MurB活性位点内维持相对稳定的结合构象。在多个候选化合物中观察到涉及TYR125和TYR254的保守相互作用，而Q13与ASN233之间的氢键相互作用可能有助于维持其与MurB的结合模式。
**MM-GBSA结合自由能分析**
MM-GBSA结果显示所有四个化合物均表现出有利的结合自由能，ΔGbind值范围为?48.09至?73.50 kcal/mol。Q9表现出最有利的结合自由能（?73.50 kcal/mol），其次为Q13（?70.45 kcal/mol）、Q12（?62.17 kcal/mol）和Q11（?48.09 kcal/mol）。这些结果为所选化合物与MurB的相互作用提供了额外的计算证据。
**主成分分析**
基于MD轨迹对Q9、Q11、Q12和Q13结合复合物进行PCA分析。前三个主成分（PC1–PC3）的累积贡献率分别为37.50%、46.25%、18.95%和30.15%。Q9结合复合物在PC1-PC2、PC2-PC3和PC3-PC1空间中表现出相对紧凑和连续的分布，表明该系统主要保持在相似的构象集合内。相反，Q11结合复合物显示明显的两个不同簇的分离，伴随最高的PC1贡献（35.17%），表明该系统采样了明显不同的构象区域。Q12结合复合物显示更分散的分布和多个填充区域，表明更广泛的构象采样行为。Q13结合复合物显示两个部分重叠的簇，代表介于Q9的紧凑集合和Q11的分离状态之间的中间构象分布。PCA表明不同抑制剂以不同方式调节MurB的整体运动和构象景观。
**讨论与结论**
本研究建立了一种结合机器学习虚拟筛选和实验验证的整合策略来鉴定潜在的大肠杆菌MurB抑制剂。研究人员鉴定了四个化合物Q9、Q11、Q12和Q13，IC??值范围为25.08至34.44 μM。细胞毒性评价表明这些化合物具有低细胞毒性，而DFT、MD、PCA和MM-GBSA分析为其电子性质、结合相互作用和构象行为提供了互补的分子层面见解。然而，所鉴定的化合物显示出有限的抗菌活性。未来研究应集中于系统的构效关系研究以指导其进一步优化。此外，内部化合物库的有限规模和化学多样性可能限制了所探索的化学空间；筛选更大和更多样化的化合物库可能有助于发现额外的MurB抑制剂骨架。此外，分子聚类后对候选化合物进行更系统的优先级排序可能提高选择结构多样性和生物学相关候选化合物的效率。
