超越M1/M2二分法：迈向一个基于操作定义的、模块化的巨噬细胞功能状态框架

《Life Sciences》：Beyond M1/M2 dichotomy: Toward an operationally defined, modular framework for macrophage functional states

摘要
巨噬细胞是多功能免疫细胞，参与组织稳态、宿主防御、炎症和疾病进展。它们的生物学特性传统上根据M1/M2范式来解释，但单细胞和空间分析、谱系追踪以及多组学研究揭示了更大的异质性。本文将巨噬细胞的多样性归纳为几个反复出现的功能程序：免疫抑制/调节、基质重塑、缺氧相关代谢、IFN响应/抗原呈递和增殖。血管生成/血管周围活性被视为一个潜在的功能程序，因为其作为独特转录实体的地位尚未确定。我们提出了一个基于三个标准（共表达一致性、组合独立性和微环境诱导性）的操作框架，以区分候选的功能模块和更广泛的功能程序。我们还对这些程序进行了基于证据的评估，考察了它们的独立变化、相互关联性和共现情况。此外，我们提出了巨噬细胞主导指数（MDI）这一用于生成假设的数值框架，包括临时的标记集、权重和需要进一步验证的公式。最后，我们提出了可检验的预测，并概述了实验、单细胞、空间和临床策略来测试这些程序之间的关系。总体而言，现有证据表明巨噬细胞的功能程序之间存在显著耦合，而不是完全独立的。因此，巨噬细胞的异质性最好理解为依赖于特定环境的程序组合，其中一些程序作为独立的转录模块尚未得到证实。尽管该框架可以广泛用于理解巨噬细胞的生物学特性，但大多数支持证据，特别是关于程序关系、生物标志物、预后和治疗意义的证据，都来自肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。其在非癌症环境中的适用性仍有待验证。MDI和提出的预测旨在促进可检验的研究，而不是作为经过验证的诊断、预后或治疗工具。

引言
巨噬细胞是免疫系统中适应性最强的细胞之一，执行多种功能，从帮助组织发育和维持平衡到抵抗感染、修复伤口和控制免疫反应[1] [2]。这些细胞不断监测周围环境，并根据身体当前的情况调整其工作方式。巨噬细胞是健康和疾病的关键决定因素，因为它们参与慢性炎症、自身免疫、纤维化和癌症[3]。它们连接先天免疫和适应性免疫，在组织保持稳定或开始发展疾病之间起着作用。这一作用几乎在所有研究过的器官中都有体现。

十多年来，巨噬细胞的激活一直用M1（经典激活的、促炎性的）/M2（alternative激活的、抗炎性的）二分法来描述，这一框架最初是模仿适应性免疫中的Th1/Th2范式设计的。这种二元框架是一个有用的初步近似方法，至今仍被广泛使用。然而，单细胞、空间分析、谱系追踪和多组学数据表明，体内的巨噬细胞很少处于彼此排他的固定状态。相反，它们结合来自发育起源、组织微环境、代谢、邻近基质细胞和疾病环境的信号，形成动态的、重叠的功能程序[4] [5]。教科书模型与数据中的多样性之间存在差距，在癌症研究中尤为明显。现在已知TAMs包含数十种转录上不同的状态，简单的M1/M2分类无法准确预测它们的临床行为[6]。该框架的概念范围比肿瘤学更广泛，因为巨噬细胞的功能可塑性也与稳态、感染、组织损伤和其他炎症状态相关。因此，我们将现有证据围绕反复出现的功能程序进行组织，而不是固定的一组等效模块。这些程序包括免疫抑制/调节、基质重塑、缺氧相关代谢、IFN响应/抗原呈递和增殖程序。血管生成/血管周围活性则被视为一个潜在的功能程序，因为其作为独特转录实体的地位仍有争议。该框架测试这些功能维度是否同时满足三个标准（共表达一致性、组合独立性和微环境诱导性），从而可以将其视为独立的模块。此外，本文还提出了MDI作为生成假设的定量工具，包括临时的标记集、权重和公式，这些都需要进一步验证。最后，我们提出了可检验的预测，并概述了实验、单细胞、空间和临床策略来测试这些程序之间的关系。

总体而言，现有证据表明巨噬细胞的功能程序之间存在显著耦合，而不是完全独立的轴。因此，巨噬细胞的异质性最好理解为依赖于特定环境的程序组合，其中一些程序作为独立的转录模块仍未得到证实。尽管该框架可以广泛用于理解巨噬细胞的生物学特性，但大多数支持证据，尤其是关于程序关系、生物标志物、预后和治疗意义的证据，都来自肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）。其在校非癌症环境中的适用性仍待验证。MDI和提出的预测旨在促进可检验的研究，而不是作为经过验证的诊断、预后或治疗工具。

引言
巨噬细胞是免疫系统中适应性最强的细胞之一，执行多种功能，包括帮助组织发育和维持平衡、抵抗感染、修复伤口和控制免疫反应[1] [2]。这些细胞不断监测周围环境，并根据身体具体情况调整其工作方式。巨噬细胞是健康和疾病的关键决定因素，因为它们参与慢性炎症、自身免疫、纤维化和癌症[3]。它们连接先天免疫和适应性免疫，处于组织稳定或开始发展疾病的临界点。这一作用在几乎所有研究过的器官中都有体现。

十多年来，巨噬细胞的激活一直用M1（经典激活的、促炎性的）/M2（alternative激活的、抗炎性的）二分法来描述，这一框架最初是为了类比适应性免疫中的Th1/Th2范式而设计的。这种二元框架是一个有用的初步近似方法，至今仍被广泛使用。然而，单细胞、空间分析、谱系追踪和多组学数据表明，体内的巨噬细胞很少处于彼此排他的固定状态。相反，它们将来自发育起源、组织微环境、代谢、邻近基质细胞和疾病环境的信号整合为动态的、重叠的功能程序[4] [5]。教科书模型与数据中的多样性之间的差距在癌症研究中尤为明显。现在已知TAMs包含数十种转录上不同的状态，简单的M1/M2分类无法准确预测它们的临床行为[6]。该框架的概念范围比肿瘤学更广泛，因为巨噬细胞的功能可塑性也与稳态、感染、组织损伤和其他炎症状态相关。因此，我们将现有证据围绕反复出现的功能程序进行组织，而不是固定的一组等效模块。这些程序包括免疫抑制/调节、基质重塑、缺氧相关代谢、IFN响应/抗原呈递和增殖程序。血管生成/血管周围活性则被视为一个潜在的功能程序，因为其作为独特转录实体的地位仍有争议。该框架测试这些功能维度是否同时满足三个标准（共表达一致性、组合独立性和微环境诱导性），从而可以将其视为独立的模块。除了综合分析外，本文还提出了几个具体贡献。需要注意的是，所提出的公式尚未根据数据推导或验证，其组成部分的分数、标记基因、标准化和权重都是临时选择的。我们不声称所选基因构成了完整的或通用的标记集，也不认为这些程序对巨噬细胞状态有相同的贡献。因此，MDI值应仅被视为模型的探索性输出，而不是经过验证的生物学或临床测量结果。

首先，我们提出了一个操作性的三标准定义，用于判断什么符合功能模块，并将其透明地应用于主要文献，包括证据与假设的模块独立性相矛盾的情况。其次，我们从这种相互依赖的模型中生成具体的、可检验的治疗预测。第三，为了使该框架具有可量化的测试性，我们提出了一个用于生成假设的预验证指标MDI。在此阶段提供明确公式的目的不是建立经过验证的评分系统，而是一个可以将来在数据集中测试、修改或拒绝的透明操作假设。所提出的公式将选定功能程序的预定义分数合并为一个单一指数。这里提出的标记基因和数学结构应被视为临时的操作选择，而不是经过实证优化的特征或巨噬细胞功能状态的权威表示。特别是，目前的公式假设各组成部分的分数贡献相等；这一假设尚未经过实证验证，仅是为了提供一个简单且可复制的起点模型。因此，使用该公式生成的MDI数值不应被视为巨噬细胞多样性的标准化测量结果、经过验证的生物标志物或具有临床意义的阈值。提出的指数旨在促进假设生成、比较和未来对模块框架的验证。这些预测并不构成结论，它们描述了可能支持或挑战该框架的观察结果，列出这些预测并不意味着这些关系已经得到证实。来自现有研究的单一发现只有在经过适当对照和独立复制的情况下才能作为验证。

MDI被提出作为一种生成假设的定量工具，用于总结IFN响应/抗原呈递活性与选定的免疫抑制和肿瘤相关程序之间的平衡。它尚未在独立转录组队列中计算或验证，因此不应被视为经过验证的生物标志物、临床验证的巨噬细胞功能障碍指标或治疗反应或生存的预测指标。所提出的组成部分特征、分数标准化和权重方案都是临时的，需要进一步的实证评估。概念验证分析应首先测试两件事：是否可以在独立数据集中重复计算这些组成部分分数，以及该指数是否能捕捉到超出巨噬细胞数量、肿瘤组成和组织环境差异的生物学变化。单细胞转录组数据可以帮助确定这些组成部分程序是否在巨噬细胞群体中共存，或者反映了细胞组成的差异。批量肿瘤数据可以提供与临床结果的相关性评估，但由于批量表达并非巨噬细胞特异性的，因此需要谨慎解释。在有合适的免疫治疗队列的情况下，应将治疗反应的相关性与预后相关性分开评估。所提出的指数还需要敏感性分析，以确定其行为是否对不同的特征定义、标准化程序和权重方案具有鲁棒性。特别是，在将这些分数视为独立的量化维度之前，应评估基质重塑和缺氧相关程序之间的潜在耦合。因此，MDI在这里被提出作为一个可检验的框架，用于未来的实证研究，而不是作为一个经过验证的转化工具。

本文使用了结构化的文献搜索和基于证据的概念综合方法来评估反复出现的巨噬细胞功能程序，并判断它们是否符合作为独立功能模块的分类标准。目标不是估计汇总效应大小或进行正式的元分析，而是考察巨噬细胞程序在实验系统和疾病背景下的连贯性、独立性和微环境调节。

搜索在PubMed、Medline、Scopus和Web of Science中进行，结合了与巨噬细胞相关的术语以及涉及功能状态、肿瘤相关巨噬细胞、转录程序、单细胞和空间分析、缺氧、免疫抑制、基质重塑、抗原呈递、血管生成和增殖的术语。相关文章的参考列表也被用来识别额外的符合条件的研究。当研究提供了与至少一个提出的功能程序或两个以上程序之间的关系相关的初级实验或计算证据时，这些研究被视为符合条件的。相关证据包括单细胞或空间转录组分析、其他分子分析方法、功能扰动实验以及研究对定义的微环境线索的反应的研究。综述用于识别相关的主要研究并提供背景信息，但在评估具体的生物学关系时并不被视为独立的初级证据。该框架主要基于关于巨噬细胞异质性的癌症文献，因此我们的搜索并未涵盖所有非癌症巨噬细胞群体。我们包括了与稳态、感染、损伤、纤维化和其他炎症状态直接相关的研究，但这些领域的覆盖并不全面。我们不对非肿瘤学领域的验证做出任何声明。

对于每个纳入的主要研究，我们记录了巨噬细胞群体和生物学背景、实验或计算方法、检查的功能程序、评估的标记基因或基因集、相关的环境线索、共表达的证据、与其他程序一起变化的证据以及支持或挑战所提关系的证据。然后，我们根据第3.1节定义的三个标准（共表达一致性、组合独立性和微环境诱导性）来评估这些证据：标记集在一个群体中的富集不足以证明这些标记在单个细胞中共表达或独立变化。同样，两个程序同时出现并不能证明其中一个依赖于另一个。

**巨噬细胞的发育和起源**
组织驻留巨噬细胞（TRMs）来源于胚胎期和出生后的连续造血波，这一发育历史是决定其基础转录和功能身份的主要因素。在第一波造血过程中，卵黄囊中的原始造血产生了直接注入早期胚胎组织的巨噬细胞，不经过单核细胞中间阶段，从而产生了如小胶质细胞这样的谱系，这些谱系通过局部自我更新持续存在到成年。在第二波造血过程中……

**巨噬细胞功能状态的模块化框架**
与M1/M2二分法不同，体内和单细胞/空间数据显示巨噬细胞同时整合了多个部分重叠的功能程序，而不是只采用两种固定状态。TAMs经常表达传统上被归类为相反极化状态的基因集。这并不反映固定的谱系承诺，而是反映了环境信号（细胞因子、代谢燃料、氧水平以及细胞间的直接相互作用）的持续整合。

**可检验的预测和潜在的验证策略**
该框架提出了几个可以通过实验或适当注释的单细胞、空间或临床数据集来验证的预测。这些预测是前瞻性的和生成假设的，以下描述的具体分析除非特别说明，否则并未作为本次综述的一部分进行。它们的目的是为未来的验证提供具体的途径，而不是暗示已有合适的数据集或实验结果。

**巨噬细胞极化：超越M1/M2的机制**
在过去十年中，巨噬细胞极化的概念已经从简单的两分模型发展为复杂的、多维的激活谱系。跨肿瘤、炎症疾病和组织修复模型的单细胞转录组研究一致显示，巨噬细胞在内部共定位，而不是分离为离散的M1或M2群体，细胞经常同时表达被归类为促炎性和调节性的基因程序。

**不同类型癌症中TAM的异质性**
TAM的表型（而不仅仅是密度）决定了其临床影响：总体TAM密度高通常与大多数实体瘤的不良预后相关，但富含IFN响应/抗原呈递TAM的肿瘤显示更好的预后和更好的检查点阻断反应，而SPP1高表达的促瘤TAM微环境（排除T细胞、缺氧）则一致预测较差的预后[65]。这种差异反映了潜在的异质性：单细胞转录组……

**针对巨噬细胞的治疗策略**
该模块化框架旨在指导治疗决策，而不仅仅是根据模块标签来分配治疗。其潜在的临床价值在于组织三个相互关联的决策：（i）哪种巨噬细胞相关功能在肿瘤中占主导地位，（ii）该功能是否得到充分支持并具有可干预性，以及（iii）哪些同时发生的或上游的程序可能限制治疗效果。因此，应结合肿瘤类型来解释候选模块的分数。预后生物标志物可分为四类：
(1) 深部髓系巨噬细胞（TAM）的密度和分布，通常通过CD68+/CD163+免疫组化方法进行检测；较高的密度通常（但不总是）与较差的预后相关。
(2) 巨噬细胞极化状态或M1/M2比值，例如HLA-DR+/CD163+比值；较高的比值预示着较好的预后。
(3) 巨噬细胞的空间分布和聚集情况，通过多重成像技术进行检测；更密集的巨噬细胞聚集与更复杂的免疫反应相关。

将这一模块化框架转化为临床实践面临若干障碍。不同研究之间的术语使用不一致，同一标志物定义的群体在不同的研究组中可能有不同的标记，这给跨研究的数据整合带来了困难。由于物种间髓系成分和标志物表达的差异，巨噬细胞信号在小鼠和人类之间的转化机制尚未完全明确。最根本的问题在于，目前对巨噬细胞不同状态之间相互关系的理解仍不充分。

当前综述的一个局限性在于，关于这些组合关系的证据在不同功能组中的分布并不均匀。一些提出的关联得到了多个独立数据集或实验系统的支持，而另一些则基于单个细胞研究或在特定肿瘤背景下进行的机制研究。后者的观察结果虽然提供了重要的假设，但无法单独证明其普遍性。

本综述表明，传统的M1/M2模型虽然在过去作为初步描述是有用的，但它并不能准确地反映巨噬细胞在不同组织、发育阶段和疾病状态下的功能。基于巨噬细胞的发育过程（第2节）、极化机制（第4节）以及主要癌症类型中TAM的异质性（第5节），我们提出了一个依赖于具体情境的框架，在该框架中，巨噬细胞的身份被理解为多种因素的组合结果。

**作者贡献声明：**
Abbas Jafari：撰写、审稿与编辑、监督
Soheil Vazifedust：撰写、审稿与编辑、可视化
Kovsar Mohammadnezhad Harmileh：撰写、初步草稿、实验设计
Fatemeh Karbasi：撰写、初步草稿、实验设计
Ebrahim Mazloomi：撰写、审稿与编辑、项目管理和概念化

**关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明：**
作者使用了Claude.ai这一AI应用程序来修正语法错误、提高某些部分的流畅性，并简化长而复杂的句子。

**资金情况：**
本研究未获得任何资助。

**关于利益冲突的声明：**
作者声明不存在可能影响本文所述工作的已知财务利益冲突或个人关系。