全血样本中磷脂酰乙醇（PEth）稳定性与从头形成的系统性研究

《Drug Testing and Analysis》：Systematic Study on Phosphatidylethanol (PEth) Stability and De Novo Formation in Authentic Whole Blood Samples

　　

摘要 磷脂酰乙醇（Phosphatidylethanols, PEth）是一组仅在乙醇存在下形成的异常磷脂。特别是，PEth 16:0/18:1 是用于监测采血前 2–4 周内酒精戒断情况的常用标志物。尽管此前已有许多研究探讨了全血中 PEth 16:0/18:1 的长期稳定性，但得出了相互矛盾的结果。本研究全面验证了一种基于液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem-mass-spectrometry, LC–MS/MS）定量检测 PEth 16:0/18:1 和 16:0/18:2 的分析方法，并利用该方法研究了不同储存条件（室温 [room temperature, RT]、4°C、?20°C 和 ?80°C）下的长期稳定性（长达 5 个月）以及在邮寄运输过程中的稳定性。研究发现，PEth 16:0/18:1 在 ?20°C 和 ?80°C 储存条件下在研究期间保持稳定，但在 4°C 下仅可保持稳定 1 个月，在室温下仅可保持稳定 7 天。与先前研究一致，PEth 16:0/18:2 在室温运输和储存过程中迅速降解。本研究首次利用来自控制饮酒实验的全血样本（而非加标样本或动物实验），在有和无体内乙醇存在的情况下，研究了 PEth 的从头形成。研究发现，在 ?20°C 和室温下储存时，早在样本采集后 14 小时即观察到显著的 PEth 16:0/18:1 从头形成，这突显了正确储存样本的重要性。应避免在 ?20°C 下储存，因为存在快速从头形成的风险。为获得可靠结果，理想情况下，短期和长期储存均应首选 ?80°C。

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一、研究背景与问题提出

磷脂酰乙醇（Phosphatidylethanols, PEth）是一组异常的磷脂，其形成严格依赖于乙醇的存在，因此可作为酒精摄入的直接生物标志物。在磷脂酶D（phospholipase D, PLD）的催化下，磷脂酰胆碱的胆碱头部基团被乙醇取代，从而形成PEth。随后，PEth在红细胞中积累，使其在血液中的检出窗口延长至数周，优于其他直接酒精标志物。目前已发现超过48种PEth同系物，其中PEth 16:0/18:1的定量结果被广泛用于评估饮酒行为，包括戒酒监测和酒精使用障碍的诊断与治疗。根据2022年巴塞尔共识，PEth 16:0/18:1浓度低于20 ng/mL可视为戒酒或低酒精摄入，高于200 ng/mL则强烈提示慢性过量饮酒，中间值表明在样本采集前3-4周内有饮酒行为。

然而，多项关于PEth 16:0/18:1在全血中长期稳定性的研究得出了相互矛盾的结论。一些研究表明其在室温下采集后24/48小时内即不稳定，而另一些则认为可稳定10天、28天甚至60天。此外，采血后样本中PEth的从头形成（de novo formation）已被识别为一个可能使结果解读复杂化的关键机制。此前对PEth新生的研究仅限于大鼠器官、人类尸检样本或体外加标的人类生前全血样本。由于PEth在人体内特异性富集于红细胞脂质双层膜中，而在加标样本中仅部分整合，导致两者稳定性差异显著。因此，利用含有或不含体内乙醇的真实人体样本进行PEth从头形成研究至关重要，而这只能通过控制饮酒实验实现。

二、研究目的与方法概述

本研究旨在全面验证一种基于液相色谱-串联质谱法（LC–MS/MS）定量检测全血中PEth 16:0/18:1和16:0/18:2的方法，并系统研究其在不同储存条件（室温、4°C、-20°C和-80°C）下的长期稳定性（长达5个月），以及在常规邮寄运输过程中的稳定性。同时，本研究首次利用来自控制饮酒研究的全血样本，探讨PEth的从头形成。研究中，26名自报社交性饮酒的志愿者被随机分为两组，分别饮用计算好的伏特加以达到0.4 g/kg或0.8 g/kg的目标血醇浓度。在饮酒事件前（neg）和饮酒开始后75分钟（pos）采集肝素钠抗凝全血样本，并在四种储存条件下保存48小时，定时分析PEth浓度。

三、主要研究方法与技术

1. 1.
   样本制备与LC–MS/MS分析：取200 μL肝素抗凝全血，加入50 μL内标溶液（PEth 16:0/18:1-D5）和50 μL异丙醇（IPA），然后用乙腈（ACN）：丙酮（85:15 v/v）进行蛋白沉淀。离心后取上清液进样。采用Shimadzu Nexera 40D X3超高效液相色谱系统耦合Sciex 7500 QTRAP质谱仪进行分析。色谱分离在Luna RP-C5柱上进行，流动相为5 mM乙酸铵：乙腈（30:70, v/v）和异丙醇，梯度洗脱，总运行时间5.7分钟。质谱采用负电喷雾电离模式和多反应监测模式。
2. 2.
   方法学验证：根据GTFCh和ANSI指南进行全面验证，包括选择性、回收率、基质效应、偏倚、精密度、β-容忍区间、校准模型及分析限（检测限LoD为6.25 ng/mL，定量限LoQ为12.5 ng/mL）。
3. 3.
   长期与运输稳定性研究：将真实匿名全血样本按浓度范围（低池：10-75 ng/mL；高池：>450 ng/mL）混合，分装后在四种温度下储存5个月，定期检测。运输稳定性实验则将三名健康志愿者的全血样本通过瑞士邮政短途和长途路线运输，并记录温度。
4. 4.
   从头形成研究：从控制饮酒实验的26名参与者（最终有效数据25人）采集饮酒前后样本，在四种温度下储存48小时，共设9个时间点进行PEth浓度测定。同时使用气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）测定血醇浓度。

四、研究结果

3.1 方法验证

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  稳定性：两种PEth同系物的峰面积在8°C自动进样器中储存30小时内下降均未超过20%。
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  选择性、回收率和基质效应：提取方法的回收率高于50%，相对标准偏差（RSD）低于20%。PEth 16:0/18:1显示中度离子抑制（80%-84%），PEth 16:0/18:2基质效应更明显（46%-54%），但重复性好（RSD<10%），不影响灵敏度。
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  偏倚、精密度、β-容忍区间：所有QC水平下的日内精密度（RSD_R）、日间精密度（RSD_T）和偏倚均在预设接受标准内（偏倚±15%，精密度≤15%），β-容忍区间符合要求。

3.2 PEth长期与运输稳定性

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  长期稳定性：PEth 16:0/18:1在-80°C和-20°C下储存5个月保持稳定。在4°C下仅稳定1个月（60天后浓度降至初始的68%）。在室温下仅稳定7天。PEth 16:0/18:2在冷冻条件下（-20°C或-80°C）可稳定5个月，在4°C下稳定30天，在室温下仅稳定3天，且分析变异性更大。
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  运输稳定性：经过短途（19.3小时）和长途（42.7小时）运输后，PEth 16:0/18:1浓度均未低于初始值的90%，表现稳定。而PEth 16:0/18:2在短途运输后即降至或低于70%的稳定性阈值，显示出更快的降解速度。

3.3 PEth从头形成

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  在目标血醇浓度为0.4 g/kg的组别中，仅在-20°C储存条件下，阳性样本（含体内乙醇）在38和48小时后表现出与阴性样本显著不同的浓度变化，即发生显著的PEth 16:0/18:1从头形成。
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  在目标血醇浓度为0.8 g/kg的组别中，-20°C储存条件下的PEth从头形成更为显著，早在储存14小时后即观察到显著差异。例如，参与者21的样本在-20°C储存48小时后，PEth 16:0/18:1浓度从低于定量限（<12.5 ng/mL）升至63 ng/mL，跨越了20 ng/mL的戒酒判定阈值。参与者18的样本在-20°C储存19小时后，浓度从170 ng/mL升至230 ng/mL，进入慢性过量饮酒的判定范围。
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  在室温储存条件下，高血醇浓度组的阳性样本也显示出浓度增加的趋势，在48小时时与阴性样本有显著差异。
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  在4°C和-80°C储存条件下，未观察到显著的PEth从头形成。

五、讨论与结论总结

本研究表明，全血是适合进行常规PEth 16:0/18:1分析的基质，是干血斑（DBS）的有效替代方案，前提是必须正确储存。实验证实PEth 16:0/18:1在-20°C或-80°C下可稳定储存5个月，但同时也发现了在-20°C和室温下储存时，早在采血后14小时即可发生显著的PEth 16:0/18:1从头形成。这一现象在-20°C下尤为突出，可能的原因是冷冻过程导致红细胞溶血，释放出膜结合的PLD，加之乙醇冰点较低，在未冻结的乙醇相中PLD浓度升高，从而促进了PEth的新生。这种从头形成可能导致临床误判，例如将戒酒状态误判为饮酒，或将适度饮酒误判为慢性过量饮酒。

研究结论：全血是适用于常规PEth 16:0/18:1分析和解读的合适基质，并且当分析挑战或机构障碍阻碍干血斑实施时，它是干血斑的一种替代方案——但前提是必须正确储存。虽然实验表明PEth 16:0/18:1在-20°C或-80°C下储存5个月具有可接受的稳定性，但本研究发现，在目标血醇浓度为0.8 g/kg时，样本在-20°C和室温下储存早至采血后14小时即发生显著的PEth 16:0/18:1从头形成。因此，应避免在-20°C下储存，而短期和长期储存全血的首选条件是-80°C，以获得可靠结果。如果在采血后立即进行快速分析，短期储存在4°C也是合适的。然而，由于PEth 16:0/18:2在非温控运输环境下会快速降解，对其浓度的解读始终应持谨慎态度。