《Drug Testing and Analysis》：Further Extensive Evaluation of GHB-Pentose as a Novel Biomarker for the Extended Detection of GHB Intake/Administration in Forensic Casework
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γ-羟基丁酸（GHB）在法医毒理学中的检测因其快速消除和内源性存在而受到阻碍。GHB-戊糖（GHB-pentose）近期作为一种有望延长GHB暴露检测窗口的生物标志物出现，但需要在真实法医学样本中进行进一步评估。研究人员采用两种基于亲水相互作用液相色谱（HIL
γ-羟基丁酸（GHB）在法医毒理学中的检测因其快速消除和内源性存在而受到阻碍。GHB-戊糖（GHB-pentose）近期作为一种有望延长GHB暴露检测窗口的生物标志物出现，但需要在真实法医学样本中进行进一步评估。研究人员采用两种基于亲水相互作用液相色谱（HILIC）和反相（RP）色谱的独立LC-MS/MS方法系统研究了GHB-戊糖。阳性发现依据测定的GHB浓度、案件信息、基质类型以及分析方法间的一致性进行评估。在2414例尿液案例中，97.6%对GHB和GHB-戊糖呈阴性。GHB-戊糖在所有21份来自活体的GHB阳性尿液样本和4份GHB阳性死后案例中均可检出，而其他20份GHB浓度升高（10–26 mg/L）的死后尿液样本则对GHB-戊糖呈阴性。基于本研究之前独立进行的毒理学专家评估，这些案例中检出的GHB更可能是死后形成的结果，而非既往GHB摄入所致。14份GHB阴性的尿液样本对GHB-戊糖呈阳性；其中8份包含支持既往GHB暴露的案件信息，包括3起疑似药物辅助犯罪案件，采样时间为事件发生后13–16小时。GHB-戊糖似乎是一种高度特异的外源性GHB暴露生物标志物，能够将检测窗口延长至超过GHB本身，并可能作为区分外源性GHB给药与内源性（尤其是死后）GHB形成的判别指标。即使在缺乏参考标准品的情况下，常规LC-MS/MS筛查也是可行的，这支持其在法医毒理学工作流程中的即时应用。
研究背景与问题
γ-羟基丁酸（GHB）是一种短链脂肪酸，因其作为滥用药物（DOA）和涉及药物辅助犯罪（DFC，特别是药物辅助性侵犯DFSA）而成为临床和法医毒理学中的重要分析物。然而，GHB的法医学检测因其快速消除和内源性存在而面临挑战。其检测窗口有限，血液中约6小时，尿液中约12小时，而内源性GHB浓度使得区分生理水平与外源性摄入变得复杂。因此，通常推荐血液中5 mg/L和尿液中6–10 mg/L的判定阈值，但在死后案例中，由于死后GHB的形成，结果解释尤为困难。为克服这些局限，研究人员致力于寻找能延长检测窗口并改善内外源性GHB区分的生物标志物。此前研究的GHB-葡萄糖醛酸苷和GHB-硫酸盐法医学价值有限；2,4-二羟基丁酸（2,4-DHB）、3,4-DHB、乙醇酸（GA）、琥珀酸（SA）和琥珀酰肉碱等代谢物虽有前景但未获确证。随后，非靶向代谢组学和假设驱动研究鉴定出多种新型GHB结合物，其中GHB-甘氨酸和GHB-戊糖被认为最有希望。尽管GHB-甘氨酸最初显示有用，但后续对照研究未能确认其比GHB本身有明显更长的检测窗口。然而，GHB-戊糖在GHB摄入后最长可检测3天，代表了迄今为止报道的最长直接GHB相关生物标志物检测窗口。尽管关于其确切结构（最可能是核糖在C1位与GHB羟基结合的β-核糖苷）尚未经核磁共振（NMR）或合成标准品确证，但现有证据表明GHB-戊糖在内源性条件下不存在，仅在GHB摄入后可检测，从而可能实现基于其存在与否的直接定性判读。
研究方法与技术
研究人员采用了两种独立的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法进行分析。第一种是经过验证的靶向GHB定量方法（HILIC法），使用亲水相互作用液相色谱（HILIC）柱，配备Sciex 5500 QTrap质谱仪，对全血和尿液中的GHB进行定量（8点校准曲线，范围0.1–82.5 mg/L），同时对GHB-戊糖进行定性筛查。第二种是多靶点尿液筛查方法（RP法），使用反相（RP）C18色谱柱，配备Sciex 6500+ QTrap质谱仪，覆盖83种分析物，包括GHB和GHB-戊糖。样本来源包括：一项在瑞士苏黎世开展的随机、平衡、双盲、安慰剂对照交叉GHB给药研究（健康志愿者21人，重度抑郁症患者19人，剂量50 mg/kg体重）的尿液样本；以及2024年至2026年间提交至研究人员实验室的2559例真实法医学案例标本（2414例尿液和145例全血，其中174例死后尿液和17例死后全血）。所有样本均在使用前完全匿名化。
研究结果
3.1 GHB-戊糖在LC-MS/MS（MRM）方法中鉴定的分析考量
研究人员从已知GHB阳性样本中推导并优化了GHB-戊糖的多反应监测（MRM）离子对（MRM1: m/z 235/103代表GHB部分，MRM2: m/z 235/89代表戊糖部分）。通过对对照给药研究中不同时间点（4.5、11和28小时）收集的尿液样本分析，发现无论采样时间、峰面积或色谱模式（HILIC vs. RP），GHB-戊糖的MRM离子比（MRM1/MRM2）均高度一致，中位数为0.072。鉴于低信号强度下变异性增加，研究人员设定了±50%（即0.036–0.108）的MRM离子比容差范围作为初步鉴定标准，这与美国国家标准学会（ANSI）的法医毒理学质谱分析建议相符。
3.2 真实法医尿液样本中GHB和GHB-戊糖的检测
在2414例尿液样本中，97.6%对GHB和GHB-戊糖均为阴性。有154例样本（占GHB阴性样本的6.5%）显示出低强度峰，但所有样本的MRM离子比均超出预设接受范围（中位比值：HILIC法0.610，RP法0.160），因此被归类为阴性。阳性发现分为三组：（a）GHB和GHB-戊糖均阳性：所有21例来自活体的GHB阳性尿液样本以及4例GHB浓度升高的死后案例均检出GHB-戊糖。（b）GHB阳性但GHB-戊糖阴性：20例死后尿液样本GHB浓度升高（10–26 mg/L）但GHB-戊糖阴性。基于独立毒理学专家评估，这些案例中的GHB更可能源于死后形成而非生前摄入，表明GHB-戊糖可能有助于区分外源性与死后内源性GHB形成。（c）GHB阴性但GHB-戊糖阳性：共14例。其中8例的案件信息支持既往GHB暴露，包括3例疑似药物辅助犯罪（DFC）案件，采样时间为事件后13–16小时，首次在真实法医学案例中证明GHB-戊糖可超越GHB自身的检测窗口。其余6例无相关信息，最高表观假阳性率为0.25%。两种LC-MS/MS方法的比较显示，在确诊和病史提示的案例中结果完全一致，而在模棱两可的案例中，第二种独立方法可提供额外证据。在36对匹配的全血和尿液样本中，尿液比全血更适于GHB-戊糖检测。此外，研究人员还排除了酮症酸中毒相关化合物（如β-羟基丁酸BHB可能的戊糖结合物）导致假阳性的可能性。
3.3 无参考标准品情况下GHB-戊糖筛查的实用建议
研究人员鼓励在没有市售参考标准品的情况下，在日常法医毒理学筛查和确证工作流程中纳入GHB-戊糖。建议至少使用10份分析确证的GHB阳性样本建立实验室特异性MRM离子比中位数，并应用±50%的容差范围。应使用至少50份无GHB摄入指征的样本评估方法选择性。需定期使用确证阳性样本作为阳性对照以验证保留时间和质谱特征。在模棱两可的案例中，可使用第二种独立色谱系统进行确认。
讨论与结论总结
GHB-戊糖是一种极具前景的直接生物标志物，能够最终延长GHB摄入的法医学检测时间窗口。尽管缺乏市售参考标准品，但本研究证明使用常规LC-MS/MS方法可靠检测GHB-戊糖是可行的。对2400多例真实尿液样本的分析显示出优异的分析特异性。重要的是，GHB-戊糖在确证GHB暴露后持续检出，但在GHB浓度升高的死后案例中缺失，表明其作为区分外源性摄入与死后GHB形成的急需标记物的潜力。若干GHB阴性但GHB-戊糖阳性的案例，包括事件后13–16小时采样的疑似DFC案例，支持了GHB-戊糖在真实案例工作中具有延长的检测窗口。此外，两种独立LC-MS/MS方法之间的强一致性证明了所提出分析策略的稳健性和可转移性。总体而言，数据支持将GHB-戊糖纳入常规法医学筛查和确证工作流程。在各实验室间的更广泛实施不仅能改善GHB暴露的检测，还能促进关于检测窗口、特异性、死后行为和临床-法医学适用性等亟需的真实世界数据的生成。在参考标准品广泛可得之前，本文概述的实用建议为GHB-戊糖在常规案例工作中的标准化实施和鉴定提供了框架。
