《Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle》：S100A9 Mediates Neuroblastoma-Associated Skeletal Muscle Atrophy via O-GlcNAcylation Repression and Activate Mitophagy Activation
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背景：在神经母细胞瘤（NB）患者中，骨骼肌萎缩是导致生存预后不良和长期生活质量下降的关键因素。然而，目前仍缺乏有效的治疗方法，其潜在机制亦不明确。由于持续性炎症是肿瘤相关肌肉萎缩的标志性特征，本研究旨在识别导致NB相关肌肉萎缩的关键炎症介质，并系统阐明其下游分
背景：在神经母细胞瘤（NB）患者中，骨骼肌萎缩是导致生存预后不良和长期生活质量下降的关键因素。然而，目前仍缺乏有效的治疗方法，其潜在机制亦不明确。由于持续性炎症是肿瘤相关肌肉萎缩的标志性特征，本研究旨在识别导致NB相关肌肉萎缩的关键炎症介质，并系统阐明其下游分子机制。方法：研究人员利用NB的不良生物学特征筛选可能导致肌肉萎缩的潜在炎症介质，随后采用NB患者血清样本和NB小鼠模型验证这些候选介质与骨骼肌萎缩的临床相关性。通过体内给予重组炎症蛋白及特定抑制剂明确介质的功能影响。此外，采用RNA测序（RNA-seq）、定量实时PCR（qPCR）和Western blotting系统研究NB诱导肌肉萎缩的潜在分子通路。结果：伴有肌肉萎缩的NB患者和NB小鼠模型中，促炎介质S100A9蛋白的血清水平均显著升高（p < 0.001）。重组小鼠S100A9蛋白在功能上降低小鼠骨骼肌重量并上调萎缩标志物TRIM63/FBXO32（p < 0.05），而其抑制剂ABR-238901在NB模型中有效减轻肌肉萎缩并下调上述萎缩标志物（p < 0.001）。机制上，S100A9通过其受体RAGE抑制骨骼肌蛋白O-GlcNAcylation（p < 0.05）。这种抑制导致BNIP3/BNIP3L介导的线粒体自噬异常激活，最终引起肌肉萎缩。最后，通过抑制该线粒体自噬途径，体内给予O-GlcNAcylation激动剂Thiamet G可显著减轻NB小鼠的骨骼肌萎缩（p < 0.05）。结论：本研究确定了S100A9是通过新型RAGE/O-GlcNAcylation/线粒体自噬轴介导NB相关骨骼肌萎缩的关键介质，确立S100A9作为潜在治疗靶点，并为早期干预策略以保留肌肉质量和改善患者预后提供了理论依据。
研究背景：神经母细胞瘤（NB）高危患者经治疗后5年生存率已超过50%，长期存活者群体不断扩大，但肿瘤及治疗相关的不良反应严重损害患者的长期生活质量。其中，骨骼肌萎缩在超过4%的NB幸存者中被观察到，可导致慢性疲劳、功能损害和生活质量下降，且可 adversely 影响预后和治疗反应。尽管临床认识不断提高，NB相关骨骼肌萎缩的驱动机制仍不明确。系统性炎症是癌症相关骨骼肌萎缩的关键驱动因素，IL-6和TNFα等炎症介质已被证实可诱导骨骼肌萎缩，但IL-6和TNF-α等在NB进展过程中并无显著变化，这一矛盾提示存在其他在NB进展中波动的炎症介质触发肌肉萎缩。S100A9是一种促炎钙结合蛋白，在骨髓转移性NB微环境中高表达，在高危NB患者血清中升高并预测不良预后，可驱动NB细胞增殖、迁移和侵袭。骨骼肌萎缩的根本驱动因素是蛋白质周转失衡，倾向于降解大于合成。翻译后修饰（PTMs）在调节蛋白质稳定性和功能中发挥关键作用。O-连接N-乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）修饰（O-GlcNAcylation）是一种动态可逆的PTM，涉及将单个N-乙酰葡糖胺部分连接到靶蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基上。维持O-GlcNAcylation稳态可保护骨骼肌免于萎缩，但其在NB诱导的肌肉萎缩中的具体变化仍知之甚少。因此，本研究旨在探究S100A9/RAGE轴及其对O-GlcNAcylation和线粒体自噬的下游效应，揭示S100A9通过RAGE介导的O-GlcNAcylation抑制和随后的BNIP3/BNIP3L依赖性线粒体自噬驱动肌肉消耗的新机制，确立S100A9作为治疗靶点并为保留NB患者肌肉质量提供机制基础。
关键技术方法：研究人员采用NB患者队列（2016—2024年上海儿童医学中心143例经病理确诊的NB患者，收集临床及CT影像数据，以第三（L3）和第四（L4）腰椎水平的腰大肌总横截面积（tPMA）Z评分作为骨骼肌萎缩的客观指标；另采集34例患者治疗前血清样本及12例患者术中腹直肌组织）及NB小鼠模型（Balb/c小鼠皮下接种Neuro-2a细胞）。细胞实验采用C2C12成肌细胞和Neuro-2a细胞。主要技术手段包括：RNA测序（RNA-seq）及基因集富集分析（GSEA）、定量实时PCR（qPCR）、Western blotting、免疫荧光、透射电子显微镜（TEM）、ELISA、重组蛋白及抑制剂体内给药（S100A9重组蛋白、ABR-238901、FPS-ZM1、Thiamet G）、siRNA敲低（siBNIP3）、以及基于GEO数据库（GSE112447、GSE49710）的生物信息学筛选。
研究结果：
3.1 血清S100A9升高与NB患者骨骼肌萎缩相关：Kaplan–Meier生存曲线显示tPMA Z评分低于?2.09的NB患者总生存期（OS）显著短于高于该截断值者。低tPMA Z评分与危险分层及肿瘤骨髓转移相关，高危或伴骨髓转移患者tPMA Z评分更低。基于NB相关骨骼肌萎缩与上述不良肿瘤临床特征的关联，研究人员从骨髓转移NB高表达基因（GSE112447）和高危NB高表达基因（GSE49710）中筛选与恶病质相关的分泌蛋白基因，发现S100A9和S100A8是骨髓转移NB肿瘤中差异表达最显著的恶病质相关分泌蛋白基因。伴有骨骼肌萎缩的NB患者血清S100A9显著升高，且与tPMA Z评分呈负相关，而S100A8及S100A8-S100A9二聚体无显著变化。高S100A9表达还预测NB患者无事件生存期和OS不良。上述结果表明S100A9不仅预测不良预后，还是NB相关骨骼肌萎缩的介质。
3.2 S100A9驱动NB小鼠肌肉萎缩：NB小鼠在肿瘤进展过程中体重和握力显著低于对照，摄食量无组间差异，排除了摄食因素对骨骼肌萎缩的贡献。NB小鼠血S100A9水平显著升高且与体重呈负相关。进一步分析显示腓肠肌和股四头肌质量降低、肌纤维横截面积减小，萎缩相关蛋白TRIM63和FBXO32上调。为检验S100A9的致病作用，研究人员给野生型小鼠注射S100A9重组蛋白、给NB小鼠注射拮抗剂ABR-238901。外源性S100A9诱导野生型小鼠体重下降和握力减退，而ABR-238901缓解NB小鼠上述缺陷。S100A9注射降低腓肠肌和股四头肌重量及纤维面积并增加TRIM63和FBXO32表达；相反，ABR-238901增加肌肉重量和纤维面积并降低TRIM63和FBXO32水平。上述结果确立S100A9是NB相关骨骼肌萎缩的关键炎症介质，靶向抑制可有效缓解肿瘤诱导的肌肉消耗。
3.3 NB诱导肌肉萎缩中O-GlcNAcylation降低：对NB小鼠萎缩腓肠肌转录组进行GSEA，揭示升高的S100A9驱动的细胞生物学过程变化，其中O-GlcNAcylation在萎缩腓肠肌中显著下调。关键酶OGT和OGA在萎缩腓肠肌中分别下调和上调。蛋白验证证实NB条件下萎缩骨骼肌中O-GlcNAcylation降低。在NB小鼠萎缩腓肠肌和股四头肌、S100A9处理小鼠及NB患者萎缩腹直肌中，O-GlcNAcylation和OGT均显著下调，而OGA在正常与萎缩组织间无一致差异。
3.4 O-GlcNAcylation下调驱动S100A9诱导的骨骼肌萎缩：研究人员使用OGT抑制剂OSMI-1和OGA抑制剂Thiamet G操纵C2C12肌管中O-GlcNAcylation水平。OSMI-1处理显著增加萎缩相关蛋白TRIM63和FBXO32并减小肌管直径。S100A9在125 ng/mL时促进O-GlcNAcylation，但在2000 ng/mL时抑制O-GlcNAcylation。相反，Thiamet G可阻断S100A9诱导的肌管直径减小并降低TRIM63和FBXO32表达。上述结果证实S100A9驱动的O-GlcNAcylation下调是肌肉萎缩的关键过程。
3.5 骨骼肌O-GlcNAcylation下调触发线粒体自噬：对OSMI-1处理后的C2C12肌管进行转录组测序，GSEA显示O-GlcNAcylation相关过程受抑制而线粒体自噬通路激活。在线粒体自噬基因中，OSMI-1上调Pink1、Bnip3和Bnip3l，但不上调Prkn。鉴于受体介导的线粒体自噬基因Bnip3和Bnip3l反应更强，研究人员聚焦于BNIP3/BNIP3L介导的线粒体自噬。OSMI-1降低线粒体膜电位，提示线粒体功能受损。OSMI-1与Baf共处理增加BNIP3、BNIP3L、p62及LC3-II/LC3-I比值。免疫荧光证实OSMI-1处理后线粒体TOMM20减少、BNIP3蓄积，BNIP3与线粒体共定位增强。S100A9重组蛋白同样诱导自噬和线粒体自噬，Baf共处理放大了S100A9诱导的BNIP3、BNIP3L、p62及LC3-II/LC3-I比值升高。为确认线粒体自噬是关键机制，研究人员采用siRNA敲低BNIP3，BNIP3敲低降低S100A9诱导的萎缩相关蛋白表达并挽救肌管直径损失。体内实验中，NB小鼠萎缩腓肠肌TEM显示线粒体空泡化和自噬体形成；腓肠肌和股四头肌中线粒体自噬蛋白BNIP3和BNIP3L增加、p62减少、LC3-II/LC3-I比值升高。S100A9诱导的萎缩腓肠肌中出现类似线粒体变化，S100A9处理小鼠肌肉及NB患者萎缩腹直肌中亦出现可比拟的蛋白变化。上述结果确立O-GlcNAcylation下调通过增强受体介导的线粒体自噬触发骨骼肌萎缩。
3.6 RAGE驱动NB相关骨骼肌萎缩：S100A9受体包括RAGE和TLR4。研究人员对NB患者萎缩腹直肌和NB小鼠萎缩腓肠肌进行RAGE和TLR4免疫荧光。患者样本中TLR4荧光无显著增加，而RAGE强度显著升高；NB小鼠萎缩腓肠肌中TLR4和RAGE强度均增加。蛋白验证证实患者萎缩腹直肌和小鼠萎缩腓肠肌中RAGE上调。为确定RAGE的功能作用，研究人员用S100A9重组蛋白联合RAGE特异性激动剂或抑制剂处理细胞。RAGE激动剂S100B促进萎缩相关蛋白表达并抑制O-GlcNAcylation和OGT水平；相反，RAGE抑制剂FPS-ZM1缓解S100A9诱导的萎缩、恢复O-GlcNAcylation并增加OGT蛋白含量。体内实验中，FPS-ZM1显著缓解NB小鼠体重下降并改善握力表现，增加腓肠肌和股四头肌重量并恢复肌纤维横截面积，上调整体O-GlcNAcylation并降低萎缩相关蛋白水平。上述结果确立RAGE是介导S100A9在NB相关骨骼肌萎缩中生物学效应的关键受体。
3.7 Thiamet G体内抑制线粒体自噬并缓解NB小鼠骨骼肌萎缩：Thiamet G缓解体重下降并显著改善握力，组间肿瘤体积无差异。Thiamet G还增加腓肠肌和股四头肌重量及肌纤维横截面积，并降低上述肌肉中BNIP3和BNIP3L表达。上述结果确立骨骼肌O-GlcNAcylation下调是NB诱导萎缩的核心过程，体内调控该通路可有效缓解表型。
讨论部分总结：本研究聚焦炎症介质S100A9探究NB相关肌肉萎缩机制，揭示S100A9通过抑制O-GlcNAcylation触发过度线粒体自噬驱动NB相关骨骼肌萎缩。体外实验显示S100A9对O-GlcNAcylation呈浓度依赖性双相效应，低浓度促进、高浓度抑制并诱导肌管萎缩，这种双相效应可能涉及受体转换：低S100A9时配体可能优先结合TLR4增强细胞葡萄糖摄取和HBP通量、增加OGT底物UDP-GlcNAc从而有利于O-GlcNAcylation升高；S100A9表达升高可上调骨骼肌RAGE，配体结合可能从TLR4转向RAGE，持续RAGE激活驱动O-GlcNAcylation下调和肌肉萎缩。体外抑制O-GlcNAcylation所需的S100A9重组蛋白浓度远高于患者血清生理水平，研究人员从血清浓度可能低估局部组织水平、体外使用重组S100A9同源二聚体而循环中主要为S100A8-S100A9异源二聚体、急性24小时暴露与体内慢性持续暴露的差异、以及重组蛋白在培养器皿塑料表面的非特异性吸附等方面进行了解释。PI3K/Akt/mTOR通路可调节OGT蛋白稳定性，RAGE受体激活可负向调控PI3K/Akt/mTOR通路，本研究观察NB小鼠模型和NB患者萎缩腹直肌中RAGE显著上调，体外证实RAGE激活显著抑制肌管O-GlcNAcylation，研究人员据此提出S100A9结合RAGE可能抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路导致OGT蛋白降解增加和表达减少、引起O-GlcNAcylation下调及异常线粒体自噬最终促进肌肉萎缩的假说，但该中间信号步骤尚未通过回补实验直接证实，有待未来通过特异性激活或抑制PI3K/Akt/mTOR通路进行机制确认。蛋白O-GlcNAcylation修饰与骨骼肌萎缩发生发展密切相关，本研究在NB模型中进一步验证了该调控关系，提示O-GlcNAcylation下调可能在不同肿瘤情境中具有普遍性；但并非所有类型骨骼肌萎缩均伴随O-GlcNAcylation下调，如地塞米松诱导的萎缩和慢性阻塞性肺疾病相关萎缩中O-GlcNAcylation反而上调，凸显其调控效应的复杂性。本研究重要发现之一是核心线粒体自噬机器的差异调控：OSMI-1处理显著上调Pink1、Bnip3和Bnip3l mRNA水平，而Prkn表达不变，提示O-GlcNAcylation下调优先激活BNIP3/BNIP3L受体介导的线粒体自噬通路而非经典PINK1/Parkin泛素依赖性级联，从而将癌症相关肌肉萎缩的现有认识细化为O-GlcNAcylation作为偏倚线粒体自噬朝向BNIP3/BNIP3L轴的关键开关。关于O-GlcNAcylation如何调控受体介导的线粒体自噬，本研究证明O-GlcNAcylation下调促进NB相关骨骼肌萎缩中的受体介导的线粒体自噬，但确切机制仍不清楚；研究人员推测该过程涉及已知O-GlcNAcylation修饰底物的转录因子活性重编程，FoxO3a是骨骼肌萎缩和自噬的核心驱动因子及Bnip3等线粒体自噬基因的转录因子，其转录活性受O-GlcNAcylation动态调控，敲低OGT可促进FOXO3A转录和活性；HIF-1α也是驱动BNIP3和BNIP3L转录的关键因子，但与FoxO3a不同，整体O-GlcNAcylation降低抑制HIF-1α的O-GlcNAcylation进而通过泛素-蛋白酶体途径促进其降解导致细胞内HIF-1α蛋白含量下降；基于本研究在小鼠模型和人样本中均证实骨骼肌O-GlcNAcylation下调，研究人员认为在NB相关萎缩骨骼肌中O-GlcNAcylation下调可能并非通过稳定HIF-1α发挥作用，相反FoxO3a修饰减少更可能解除对FOXO3a的限制、促进其转录和转录活性进而上调BNIP3和BNIP3L表达最终驱动线粒体自噬增强。骨骼肌并非代谢均一的组织，躯干肌和肢体肌在肌纤维类型组成及氧化与糖酵解代谢偏倚方面存在显著差异，决定其对分解代谢刺激的敏感性；在包括癌症恶病质在内的消耗性疾病中，快收缩糖酵解纤维（II型）通常更易受损，而慢收缩氧化纤维（I型）在一定程度上受PGC-1α依赖性程序保护。就纤维类型而言，约50%的腹直肌纤维为I型、50%为II型，股四头肌也约50% I型、50% II型，59%的腓肠肌为I型、41%为II型，约45%的腰大肌为I型、55%为II型；基于II型纤维更易受分解代谢刺激影响的特征，腰大肌中II型纤维比例最高，可能在肿瘤影响下更早萎缩。本研究中患者以tPMA Z评分区分萎缩，鉴于腰大肌中II型纤维比例较高且对肿瘤影响敏感，该评分能够更早识别肌肉萎缩患者。本研究选择腹直肌作为验证组织是因为其在多数腹部肿瘤手术中易于获取，且是既往癌症相关肌肉变化研究中最常用的采样部位之一；然而腹直肌能否完全代表与恶病质相关的全身肌肉变化尚未充分证明，但恶性疾病对骨骼肌的多数假定效应包括循环肿瘤和炎症介质、激素水平变化及能量和必需营养素缺乏均为全身性的；此外为确保采集的腹直肌确实受肿瘤影响且处于萎缩状态，本研究所有验证实验均使用tPMA Z评分显著降低患者的腹直肌样本，验证实验证实这些萎缩患者的腹直肌确实具有萎缩表型和相应分子变化，因此研究人员认为腹直肌可作为验证NB患者骨骼肌萎缩的代表性肌肉组织。本研究存在若干局限性：第一，O-GlcNAcylation调控线粒体自噬的作用尚未完全阐明，O-GlcNAcylation调控线粒体自噬的详细机制将是未来研究方向；第二，关于人体组织验证，仅能获得腹直肌样本且进一步确认线粒体自噬的技术有限，这是因为临床样本仅在NB手术期间获得，无法从患者采集腓肠肌样本，有限的样本量限制了额外验证实验的范围，因此研究人员计划继续收集患者腹直肌样本以进一步扩展NB研究的骨骼肌样本库；第三，尽管本研究在雄性小鼠中证明S100A9通过调节OGT和O-GlcNAcylation诱导NB小鼠模型骨骼肌萎缩，未来研究应纳入雌性队列以探究这些发现是否具有性别特异性。
研究结论翻译：本研究揭示了一条新通路，即NB患者血清S100A9升高触发骨骼肌萎缩。其机制涉及S100A9介导的蛋白O-GlcNAcylation抑制，后者随后加速线粒体自噬，导致肌肉丢失。本研究强调了异常O-GlcNAcylation在萎缩过程中驱动线粒体自噬的关键作用，并为制定靶向治疗策略以减轻NB幸存者肌肉消耗提供了重要见解。
