缺铁性贫血骨骼肌重塑及静脉铁剂治疗后恢复的分子与功能研究

《Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle》：Remodelling of Skeletal Muscle During Iron Deficiency Anaemia and Recovery After Intravenous Iron Therapy

　　

背景：缺铁性贫血（IDA）全球患病率约25%，在育龄女性和儿童中更高。IDA可通过破坏氧利用、能量产生和收缩功能损害骨骼肌。静脉（IV）铁剂治疗IDA的血液学效应已被充分研究，但其对肌肉和能量代谢的影响尚不清楚。研究人员在小鼠模型和C2C12肌管中研究了IDA对骨骼肌的分子和功能影响，并在缺铁C2C12肌管、IDA小鼠和IDA患者中比较了不同IV铁剂制剂对骨骼肌的影响。方法：通过尾静脉注射2 mg铁，在IDA小鼠中研究IV铁剂制剂羧基麦芽糖铁（FCM）和异麦芽糖酐铁（FDI）的治疗效果，治疗后7天和4周进行分析。C2C12肌管经去铁胺处理后，在分析线粒体呼吸、基因表达和代谢物谱之前与FCM或FDI孵育。在一项随机临床试验中，以FCM或FDI治疗的IDA成人为对象，作为探索性终点研究呼吸肌功能。结果：在小鼠模型中，IDA诱导骨骼肌功能受损的趋势和向无氧代谢的转变。与IDA相比，仅FDI治疗导致I型和IIb型肌纤维横截面积显著增加。FDI也比FCM更早诱导收缩蛋白表达和能量代谢的恢复。探索性蛋白质组学和代谢分析显示，FDI治疗可能在7天后恢复线粒体酶并减少乳酸积累。在体外，缺铁C2C12肌管显示线粒体呼吸减少和糖酵解增加，两种IV铁剂制剂均部分恢复。在IDA成人治疗两周后，FDI在最大呼气压力方面比FCM产生显著更好的改善（治疗间平均压力差5.06 cmH₂O，p = 0.013）。这种差异似乎与治疗后低磷血症无关。结论：IDA通过代谢和结构重塑在小鼠中显示骨骼肌功能受损的趋势，FDI和FCM以不同动力学恢复这些改变。这些发现与临床研究的探索性发现一致，表明FDI治疗的IDA患者呼吸肌恢复优于FCM治疗。细胞培养实验证实IDA对代谢受损的影响，但未显示FCM和FDI的差异效应。不同的组织药代动力学可能解释两种制剂不同的体内反应。

研究背景：缺铁性贫血（IDA）影响全球约25%的人口，在育龄女性和儿童中患病率显著更高。IDA的血液学后果包括小细胞低色素性贫血和血小板增多症已被充分确立。铁缺乏还影响高能量需求组织，包括脑、心脏和肌肉。骨骼肌功能依赖于充足的氧输送以通过氧化磷酸化产生能量。贫血导致的氧供应不足或铁依赖酶活性降低引起的氧利用减少可导致疲劳和运动能力下降。铁在骨骼肌生物学中起关键作用，作为线粒体呼吸链复合体、氧化代谢酶和肌红蛋白的辅因子。铁缺乏不仅通过引起贫血减少氧运输，还破坏能量产生、损害收缩功能并诱导结构改变包括纤维萎缩和结构紊乱。动物和人类研究表明静脉（IV）铁剂可纠正铁缺乏和运动表现，但将铁补充与骨骼肌铁缺乏的结构和代谢恢复联系起来的直接机制证据尚缺。羧基麦芽糖铁（FCM）和异麦芽糖酐铁（FDI）是广泛使用的IV铁剂制剂，具有不同的碳水化合物部分和不同的药代动力学特征。两者均有效纠正贫血和恢复体内铁储备。然而，低磷血症是IV铁剂治疗的已知不良反应，在约47%–75%的FCM治疗患者中发生，而FDI治疗显示较低的发生率（4%–8%）。运动员铁缺乏研究显示FCM可改善运动能力，但其对骨骼肌结构和功能的影响尚不清楚。此外，IV铁剂治疗后线粒体功能和肌肉结构如何及何时恢复仍不清楚。研究人员在IDA小鼠模型中检查了FCM或FDI治疗后肌肉形态、功能和能量代谢的变化，在分化的C2C12小鼠成肌细胞中进一步研究了肌管对铁耗竭和IV铁剂补充的代谢反应，并在一项比较FCM和FDI治疗IDA患者效果的前瞻性临床试验中作为探索性分析研究了呼吸肌功能的临床效应。

关键技术方法：研究人员采用3周龄雌性C57BL/6J小鼠通过缺铁饮食联合反复放血诱导IDA，经尾静脉注射2 mg FCM或FDI，在治疗后1周和4周采集腓肠肌、比目鱼肌、跖肌和膈肌进行分析。细胞实验使用小鼠C2C12成肌细胞分化9天后以100 μM去铁胺（DFO）处理24小时诱导铁缺乏，再与200 μg/mL FCM或FDI孵育24小时。采用Seahorse XF细胞线粒体应激测试试剂盒评估氧消耗率（OCR）。临床样本来源于先前发表的FCM与FDI比较的随机试验（Phosphare-IDA研究，ClinicalTrials.gov标识符：NCT03238911和NCT03237065），在基线、第14天和第35天进行最大吸气压力（MIP）和最大呼气压力（MEP）测量。蛋白质组学、代谢组学、基因表达分析、原子吸收光谱法测定组织铁浓度、DAB增强铁染色和电子显微镜检查等详细方法见支持信息。

研究结果：

3.1 缺铁性贫血诱导的萎缩和肌肉功能受损被IV铁剂治疗部分纠正
通过线悬挂实验评估肌肉功能，IDA和FCM治疗小鼠的掉落潜伏期短于对照组或FDI治疗小鼠。FDI治疗小鼠在第二次重复中显著改善而FCM治疗小鼠未见改善。膈肌肌球蛋白重链（MyHC）染色显示IDA小鼠所有纤维类型横截面积呈减少趋势。FDI而非FCM治疗在注射后4周显著增加I型和IIb型纤维横截面积，但1周时未增加。1周时氧化型（I型）纤维横截面积与血红蛋白浓度在所有组中显著相关（r = 0.28；p = 0.03）。4周时FDI治疗小鼠血红蛋白和纤维大小进一步增加，而FCM治疗动物仅血红蛋白而非纤维大小进一步增加。IDA小鼠肌肉较小且苍白，FCM和FDI治疗后恢复。这些数据表明IDA导致肌肉功能受损和萎缩，FDI比FCM恢复更好，尽管两者对血液学参数的影响相当。

3.2 蛋白质组学分析揭示IDA能量代谢受损及FDI治疗后收缩蛋白早期恢复
对腓肠肌进行定量蛋白质组学分析，限制于2920个在所有个体样本中均有丰度测量的蛋白质。经Benjamini–Hochberg多重检验校正后，蛋白质丰度差异不再具有统计学显著性，因此后续差异丰度和通路分析被视为探索性。对照与IDA小鼠比较显示骨骼肌蛋白质表达失调。铁相关蛋白如转铁蛋白受体（Tfrc）和转铁蛋白（Tf）及腺苷酸激酶4（Ak4）在IDA中强烈上调。线粒体NADH脱氢酶亚基（Ndufa12、Ndufv2）和琥珀酸脱氢酶复合体铁硫亚基B（Sdhb）下调，提示IDA动物氧化磷酸化破坏。下调蛋白的基因本体（GO）富集分析证实线粒体功能和ATP合成受损。FDI治疗与FCM治疗IDA小鼠比较，FDI组肌球蛋白重链和肌钙蛋白表达更高。FDI上调蛋白的GO富集支持肌肉收缩通路的早期激活。蛋白质-蛋白质相互作用网络分析识别出富含肌肉收缩蛋白的簇。FDI治疗还诱导IDA中下调的肌球蛋白重链蛋白表达的快速恢复。这些蛋白质组学分析提示FDI治疗动物比FCM治疗动物收缩机器恢复更快。

3.3 IDA治疗导致肌肉铁含量增加及上调的转铁蛋白受体mRNA纠正
通过原子吸收光谱法量化骨骼肌铁浓度。IDA小鼠组织铁浓度数值上低于对照小鼠但差异未达统计学显著性。IV给予FCM或FDI后1周，骨骼肌铁浓度显著升高并持续至注射后4周。基因表达分析显示IDA小鼠Tfrc mRNA显著上调，IV铁剂治疗后1周完全逆转并在4周时保持低水平。相应地铁摄取相关基因在IDA小鼠中上调而铁输出和储存相关基因下调。铁-硫（Fe–S）簇结合线粒体肽在IDA小鼠中较对照下调并在IV铁剂治疗后部分恢复。DAB增强染色显示IDA动物中未检测到可染色铁，而FCM和FDI治疗后4周在肌内膜观察到点状Fe³⁺阳性沉积物，未检测到Fe²⁺。可染色铁局限于肌纤维之间区域，FCM和FDI治疗之间无差异。电子显微镜确认IV铁剂治疗小鼠腓肠肌中巨噬细胞内电子致密包涵体，鉴定为铁内溶酶体。总之，IDA治疗导致组织铁浓度升高，可染色铁主要在巨噬细胞中发现。基因表达模式表明IDA中铁摄取增加和铁储存减少，两种IV铁剂制剂均可逆转。

3.4 FDI优先逆转IDA诱导的向无氧糖酵解和乳酸产生的转变
在IV铁剂治疗后1周量化骨骼肌中糖酵解和三羧酸（TCA）循环代谢物。IDA小鼠代谢物浓度表明从有氧向无氧能量代谢转变，细胞内葡萄糖水平升高仅在FDI后正常化而在FCM后仍保持高水平。葡萄糖/果糖-6-磷酸（G/F-6-P）总和在IDA中相对所有其他组显著升高。FDI给药后丙酮酸浓度降低并伴随最高柠檬酸水平。与氧化磷酸化减少一致，丙酮酸羧化酶（Pc）在IDA中强烈下调并在FCM治疗后仍受抑制，导致显著细胞内乳酸积累（p ≤ 0.05），而FDI增加Pc表达并减少乳酸。在蛋白质水平，几乎所有TCA循环酶在IDA中相对对照下调，铁剂治疗后1周部分恢复。铁依赖酶包括乌头酸酶2（Aco2）和多个琥珀酸脱氢酶亚基（Sdha、Sdhb）在IDA中显示显著降低。相反，TCA循环代谢物浓度在对照和IDA之间无显著差异。然而，除柠檬酸外，大多数其他TCA中间产物在FDI后低于FCM。总之，这些数据显示IDA小鼠骨骼肌向糖酵解能量产生转变，主要由FDI逆转而FCM逆转较少。

3.5 铁缺乏的代谢后果及铁补充对C2C12肌管的影响
使用体外铁缺乏模型 mechanistically 剖析这些通路。小鼠肌管（C2C12）未经处理、单独DFO处理或在DFO预孵育后与FCM或FDI孵育。DFO处理细胞与对照比较的代谢改变分析显示嘌呤和嘧啶代谢、糖酵解、脂肪酸氧化和多胺生物合成中间产物显著积累。积累的代谢物主要聚集在铁依赖酶促步骤上游，表明铁缺乏引起的代谢瓶颈。相反，TCA循环和甘油磷脂代谢代谢物显示浓度降低。火山图分析确认这些变化，突出显示绝对log₂倍数变化 > 1且Benjamini–Hochberg校正p值 < 0.05的代谢物，表明DFO诱导的铁缺乏中向无氧糖酵解伴乳酸积累的代谢转变。补充FCM或FDI部分恢复这些代谢改变，两种制剂在体外效果相似。基因表达分析显示DFO处理细胞中乳酸脱氢酶A（Ldha）较对照显著上调，铁剂治疗后逆转，而DFO培养中升高的细胞外L-乳酸在铁补充后仍未改变。总之，细胞培养中DFO诱导的铁缺乏导致一碳、核苷酸、氨基酸和脂质代谢的协调重塑，表明向无氧糖酵解转变伴乳酸产生增加和脂肪酸氧化受损。铁补充部分恢复代谢谱，两种制剂之间无显著差异。

3.6 小鼠肌管对铁缺乏的反应表现为氧消耗减少和转铁蛋白受体mRNA增加，FCM和FDI同等纠正
Seahorse呼吸测量显示铁螯合显著（p ≤ 0.0001）降低基础和最大氧消耗率（OCR），表明线粒体功能受损。FCM和FDI在24小时后导致显著恢复，制剂之间无明显差异。当肌管在寡霉素和FCCP（羰基氰化物-4-[三氟甲氧基]苯腙）处理后受到应激，DFO处理肌管表现出增加的糖酵解依赖，而FCM和FDI处理细胞显示相对对照显著改善但仍不完全的氧化适应能力。免疫印迹显示DFO处理细胞中氧化磷酸化（OXPHOS）复合体表达降低，铁剂治疗后恢复，而线粒体拷贝数在DFO处理后无显著差异。在转录水平，铁缺乏导致Tfrc mRNA显著（p ≤ 0.0001）增加，两种铁化合物治疗后均恢复至基线。电子显微镜和FerroOrange染色确认C2C12肌管直接铁摄取。相反，Dmt1 mRNA表达在DFO暴露或后续FCM或FDI治疗中未变化。Zip14 mRNA水平在DFO后显著降低（p ≤ 0.01），两种IV铁剂制剂治疗后未变化。这些发现表明骨骼肌细胞对铁耗竭的协调生物能量和转录反应，在体外FCM和FDI治疗后改善。

3.7 FDI改善IDA成人呼吸肌功能
基于IDA小鼠模型中FDI比FCM显示更好的骨骼肌功能改善的发现，研究人员分析了Phosphare-IDA研究中接受FCM或FDI治疗的IDA患者呼吸肌功能，作为探索性终点收集。最大呼气压力（MEP）和最大吸气压力（MIP）被评估为呼吸肌功能的替代指标。比较治疗前、治疗后14天和35天治疗组间肌肉功能，FDI治疗患者MEP增加显著强于FCM治疗患者。这种从基线的增加在FDI治疗后14天已存在并维持至第35天。FCM治疗患者在此期间相对基线无显著改善。MIP测量的组间差异不如MEP明显。由于低磷血症在74%的FCM治疗患者中发生而仅8%的FDI治疗患者中发生，FDI和FCM对肌肉功能的差异效应也按治疗后磷酸盐浓度分组。FDI后极少患者发生低磷血症限制了该分析的统计效力，但未发现低磷血症与呼吸肌功能恢复程度之间的关联。这些发现提示在IDA成人中，FDI治疗可能与比FCM治疗更显著和更快速的MEP改善相关，与小鼠模型中观察到的发现一致。

讨论部分总结：在小鼠中，IDA导致纤维萎缩、收缩功能受损趋势和向无氧能量代谢转变。IV铁剂治疗改善铁缺乏肌肉的功能、形态和分子改变。在培养的小鼠肌管中，FCM和FDI在DFO处理后恢复细胞能量代谢方面效果相似。IDA人类呼吸肌功能在FDI治疗后似乎比FCM治疗后改善更快。早期人类和动物研究表明铁缺乏可导致骨骼肌能量代谢受损。研究人员数据显示IDA中代谢重塑揭示从氧化磷酸化向无氧糖酵解的转变，反映为细胞内乳酸积累。FDI和FCM不仅在生化上而且在功能上具有不同特性，FDI治疗IDA小鼠导致更快的肌肉恢复。这些发现得到人类肌肉功能探索性分析的支持，FDI治疗后呼吸肌功能参数MEP恢复似乎更快速和更显著，尽管FCM治疗后铁剂量更高和血红蛋白反应更大。先前工作表明骨骼肌通过细胞自主和系统机制响应铁可利用性变化，包括器官间交叉对话、铁蛋白自噬驱动的肌源性细胞重塑和巨噬细胞介导的局部铁处理。 accordingly，IDA小鼠骨骼肌Tfrc表达显著增加但总铁含量仅呈降低趋势，提示肌肉直接铁感知。IV铁剂治疗后肌肉总体浓度增加不一定表明肌纤维中生物可利用铁的补充，因为IV铁剂导致间质巨噬细胞持续铁积累长达4周。Tfrc mRNA水平在治疗后1周即正常化，而代谢稳态未完全恢复。基于这些观察，研究人员假设体内有效肌肉适应可能涉及巨噬细胞铁向肌纤维的逐渐转移，但本研究未直接证明这种巨噬细胞向肌纤维的铁转移。FCM和FDI可将微量不稳定铁直接释放至血浆或经巨噬细胞摄取后溶酶体降解碳水化合物外壳。除铁释放差异外，FCM和FDI还可差异生物分布至不同组织，这与研究人员发现的独特肌肉铁生物可利用性一致。尽管IDA小鼠血液学反应相当，FDI始终产生更快的代谢和功能恢复，这与FCM处理细胞溶酶体铁释放慢于其他铁剂制剂的数据一致。这种差异可能进一步反映两种铁剂制剂在铁释放动力学和组织药代动力学方面的差异。近期工作还表明FCM和FDI在纠正IDA期间对磷酸盐稳态的影响不同，尽管血液学疗效相当。在小鼠模型中，血浆磷酸盐仅在IV铁剂治疗后1周测量，未显示FCM治疗动物磷酸盐降低，使磷酸盐不太可能驱动观察到的肌肉表型。研究人员发现支持涉及系统性贫血伴氧运输减少和骨骼肌内区室特异性或功能性铁限制的联合机制，后者未被总体组织铁测量完全捕获。细胞培养发现显示FCM和FDI同等正常化DFO处理后增加的Tfrc mRNA表达和能量代谢，尽管不能完全排除DFO的更广泛细胞应激效应。这表明体外细胞可直接获取FCM和FDI中的铁，绕过组织药代动力学差异引起的效应。C2C12肌管电子显微照片显示FCM和FDI处理细胞中内溶酶体细胞器充满代表铁偶联物的电子致密颗粒，FerroOrange染色确认。这表明C2C12肌管可在无巨噬细胞情况下内化FCM和FDI复合物。相反，小鼠肌纤维电子显微镜在检查条件下未显示此类包涵体。IV铁剂治疗后观察到的肌内膜巨噬细胞铁积累可能反映间质巨噬细胞的局部铁隔离和缓冲。虽然这些细胞可作为局部铁储库并可能有助于后续向肌纤维再分布，但数据未直接证明巨噬细胞向肌纤维的铁转移。先前研究显示铁缺乏通过降低铁依赖酶包括核糖核苷酸还原酶的活性损害核苷酸合成。体外代谢组学分析确认核苷酸生物合成受损，显示DFO引起肌苷磷酸和次黄嘌呤最大增加。总之，这些发现强调铁缺乏影响细胞代谢 beyond 能量产生和氧化磷酸化。本研究局限性包括线悬挂测试中的功能表现不能归因于单一生理成分，该测试反映肌肉力量、神经肌肉功能、动机、协调和抗疲劳性的组合。分子改变仅在严重IDA动物和DFO处理细胞中分析。小鼠相对人类基于体重使用较高IV铁剂量。尽管如此，转化发现提示IDA人类中FDI可比FCM更快速改善呼吸肌功能 despite 更高FCM剂量，但临床相关性取决于临床环境。呼吸肌功能在围手术期医学中具有相关性。为将观察到的约5 cmH₂O更高MEP的效应量置于背景中，一项研究显示MEP是结局的独立预测因子，每cmH₂O转化为拔管失败几率降低4%。尽管Phosphare-IDA研究未在插管通气患者中进行，这些探索性发现可能对术前接受IV铁剂治疗的患者具有潜在意义。

研究结论翻译：总之，研究人员发现表明IDA可通过影响线粒体和核苷酸通路的协调代谢重编程损害骨骼肌功能。用FDI纠正IDA导致比FCM更快的功能恢复，尽管血液学反应动力学相同，而无相关巨噬细胞的C2C12细胞显示制剂之间无差异。这些发现提示制剂差异和可能不同的组织药代动力学可解释体内观察到的功能结局差异。研究结果可帮助优化IDA治疗并强调IV铁剂治疗如何改善骨骼肌健康和功能。