基于质体基因组的系统发育基因组学解析珍珠菜属（Lysimachia）系统发育复杂性并揭示L. thyrsiflora的意外位置

《Ecology and Evolution》：Plastome-Based Phylogenomics Resolves Phylogenetic Complexity in Lysimachia and Reveals Unexpected Placement of L. thyrsiflora

　　

珍珠菜属（Lysimachia）在分类学上较为复杂，尤其在东亚地区。研究人员分析了四种珍珠菜属物种（L. acroadenia、L. leucantha、L. thyrsiflora和L. arvensis）的完整叶绿体（cp）基因组。这些cp基因组长度为153–155 kb，呈现典型的四分体结构。比较分析鉴定出两个高变区，可作为有前景的分子标记。大多数蛋白质编码基因的Ka/Ks比值低于1，但rps12和psaI显示出升高的Ka/Ks比值，需通过基于密码子的选择检验进一步验证。最大似然系统发育树证实了珍珠菜属的单系性。重要的是，L. thyrsiflora聚类于珍珠菜亚属（subgenus Lysimachia）珍珠菜组（section Lysimachia）内，这与其传统分类相矛盾，并提示可能存在复杂的生物地理历史，或涉及白令陆桥（Bering Land Bridge）的历史联系。分化时间分析估计该属起源约在33百万年前（Mya）。研究结果厘清了关键分类群的系统发育地位，并为珍珠菜属未来的进化与分类学研究提供了必要的基因组资源。

研究背景与问题：珍珠菜属（Lysimachia）隶属于报春花科（Primulaceae）紫金牛亚科（Myrsinoideae），全球约280种，东亚地区多样性最高，约170种。该属自Klatt、Knuth、Handel-Mazzetti至Chen & Hu历经多次亚属划分修订，Chen & Hu将其分为六个亚属：Idiophyton、Lysimachia、Palladia、Heterostylandra、Naumburgia和Lysimachiopsis。分子研究虽支持该属单系性，但部分类群间存在多分枝与关系不确定问题；叶绿体系统发育与核系统发育之间的不一致提示需要更广泛的质体基因组取样以厘清属内关系与物种归属。韩国已知分布16个珍珠菜属分类群，本研究选取分布于湿地与岛屿特定生境的四个物种，其中L. thyrsiflora传统上被置于Naumburgia亚属，本研究首次以其作为该亚属代表分析叶绿体基因组。研究目的为：表征所研究分类群的叶绿体基因组结构与序列变异；鉴定可作为候选分子标记的变异区并考察核苷酸替换模式；评估完整叶绿体基因组数据能否厘清系统发育关系及分类地位不确定类群的归属。研究开展与结论：研究人员对四个物种进行叶绿体基因组测序、组装与注释，并与已发表的45个珍珠菜属叶绿体基因组（合计49个）进行比较分析，构建了包含49个珍珠菜属与3个外类群的系统发育树并估算分化时间。结论为：珍珠菜属为单系；L. thyrsiflora与珍珠菜亚属珍珠菜组（含L. davurica与L. vulgaris）聚为一支，而非其传统分类位置；该属约在33 Mya（早渐新世）发生分化。意义：研究厘清了关键分类群的系统发育地位，提供了可用于分类解析的基因组资源，并提示基于分子系统发育证据对亚属划分进行重新评估的必要性。

关键技术方法：采集四个物种自然生境的新鲜叶片，以Exgene Plant SV Kit提取基因组DNA，经Nano-200分光光度计与1%琼脂糖凝胶电泳检测质量；基于Illumina HiSeq2500平台进行双端测序（插入片段550 bp），每个文库正反向各获得约3 Gb原始数据；使用Velvet v1.2.10进行从头组装，在Geneious Prime v2025.1.2中经参考组装评估覆盖度，以GeSeq与NCBI BLASTN注释、OGDRAW可视化；采用mVISTA（shuffle-LAGAN模式，以L. europaea为参考）比较序列相似性，用MAFFT比对、DnaSP v6.12.03计算核苷酸多样性（Pi，窗口800 bp、步长200 bp）；以MISA-web、Phobos、REPuter分析简单序列重复（SSR）、串联重复与散在重复；基于76个共享蛋白质编码基因计算相对同义密码子使用度（RSCU）及非同义（Ka）/同义（Ks）替换率；以IQ-TREE v2.4.0（GTR + F + R4模型，1000次自举重复）构建最大似然（ML）树，以BEAST v1.10.4进行贝叶斯分化时间分析（宽松分子钟、对数正态分布、3亿步MCMC，两个校准点）。

研究结果：

3.1 四个珍珠菜属叶绿体基因组的一般特征：四个cp基因组长度为153,325–155,181 bp，均由大单拷贝区（LSC）、小单拷贝区（SSC）与两个反向重复区（IRa/IRb）组成，共含113个独特基因（85个蛋白质编码基因、30个tRNA基因、4个rRNA基因），因IR区重复而总基因数为130个；GC含量为36.8%–37.0%，IR区GC含量最高，其次为LSC与SSC；L. thyrsiflora中tRNA基因GC含量最高，其余物种中rRNA基因GC含量最高。

3.2 序列分歧比较分析：mVISTA结构分析将分类群分为两大组，第一组为基部谱系（含subg. Naumburgia、subg. Lysimachia sect. Lysimachia、subg. Idiophyton、Anagallis分支与Trientalis分支），第二组为其余类群；第二组在基因间间隔区（IGS）鉴定出两处明显缺失，分别约600 bp（petN-psbM）与约450 bp（ycf3-rps4）；IR区整体高度保守。IR与SC边界比较显示，L. chekiangensis的LSC最长（85,181 bp），L. stenosepala的SSC最长（18,203 bp），L. capillipes的IR最长（26,258 bp）；多数类群rps19位于LSC/IRb边界，subg. Palladia sect. Miltandrae部分物种的rps19完全位于LSC内（IR收缩），subg. Idiophyton中rps19大部分位于IRb内（IR扩张）；L. stenosepala中ycf1在SSC内以假基因形式存在。核苷酸多样性平均为0.013，IR区Pi < 0.01；最高Pi（0.052）见于SSC的ycf1区，其次为SSC的ndhF-rpl32区（0.038），LSC区trnK-rps16、rpl22与rpoB-psbM均为0.035。

3.3 重复序列比较分析：SSR数目为37（L. coreana）至68（L. alfredii），共鉴定2250个SSR，单核苷酸占95.2%、二核苷酸3.7%、三核苷酸0.9%、四核苷酸0.04%（仅见于L. arvensis）；串联重复为37（L. europaea）至68（L. hemsleyi），共4104个，单核苷酸占69.15%；散在重复为12（L. europaea）至42（L. chekiangensis），共937个，正向重复最多（53%），其次为回文重复（40.6%）；重复总数从L. europaea的118个至L. alfredii的185个。

3.4 RSCU分析：密码子使用模式在全部物种间高度保守，高RSCU密码子包括UUA（Leu）、GCU（Ala）、UCU（Ser）与ACU（Thr），低RSCU密码子包括CUG（Leu）、AGC（Ser）与UAC（Tyr）；密码子第三位以A或U为主，显示整体AT偏好。

3.5 非同义与同义替换估计：多数基因Ka低于0.02，rpl22与rpl32超过0.02；多数基因Ks低于0.05，ndhF、rps8、petD、rpl22、psaJ、psbK、rpl14与rps19超过0.05；多数基因Ka/Ks低于1，而rps12（1.21）与psaI（1.17）大于1。

3.6 系统发育分析：基于76个共享蛋白质编码基因构建的ML树显示珍珠菜属为单系；多数亚属为单系，但若干组未形成单系群；L. thyrsiflora归入珍珠菜亚属珍珠菜组并与L. davurica、L. vulgaris聚类；原属Anagallis的L. arvensis形成长枝；L. acroadenia位于Palladia亚属基部，与中国和日本分布的珍珠菜属物种关系较近；L. leucantha位于Palladia亚属上部，二者均具高自举支持值。分化时间分析表明该属于早渐新世约33 Mya（95% HPD：24.47–42.99 Mya）分化，多数亚属自中新世中期约15 Mya或更早开始分化。

讨论部分总结：比较分析表明珍珠菜属cp基因组整体结构高度保守，序列分歧主要集中于单拷贝区，IR区因重复性质抑制大规模重排而保持稳定；petN-psbM与ycf3-rps4的缺失可能为界定特定谱系的共有衍征，IR/SC边界位移提示局部结构演化，可作为解析亚属关系的潜在基因组标记；RSCU的保守性反映叶绿体基因表达与翻译效率的功能约束；Ka/Ks分析支持纯化选择，但rps12与psaI的升高比值仅为初步信号，需基于密码子的选择检验与更多基因组证据验证。ycf1与ndhF-rpl32等高Pi区及种间差异明显的重复序列，结合核苷酸多样性，可作为区分形态相似类群的诊断特征，并应用于植物检疫与药用植物材料鉴定，但其物种界定效用需更广泛的种内种间取样、独立核标记与形态学证据验证。系统发育方面，亚属水平上叶绿体基因组结构与系统发育划分大体一致，但传统形态性状未能反映叶绿体基因组的进化信号，若干组为非单系，提示需结合基因组结构特征与形态性状重新评估亚属分类；L. thyrsiflora与珍珠菜组的近缘关系获得质体基因组证据支持，其欧亚—北美间断分布可能反映复杂的生物地理历史，白令陆桥迁移为一种可能解释，但本研究未进行祖先分布区估算或基于模型的生物地理重建，该解释应视为暂定；L. coreana形成独立分支，支持其作为遗传上独特谱系的地位并提示需重新评估其分类；该属于早渐新世分化、多数亚属约15 Mya分化，提示两次主要降温事件影响属内物种形成；但叶绿体基因组为单亲母系遗传，可能受杂交、不完全谱系分选与叶绿体捕获影响而与核系统发育不一致，需结合核基因组数据的转录组系统发育基因组学分析进一步评估。结论译文：本研究对四种珍珠菜属物种的cp基因组进行了测序与表征，为分类解析提供了必要的基因组数据。比较分析鉴定出热点区域（ycf1、ndhF-rpl32），可作为潜在分子标记。替换率分析发现rps12与psaI基因Ka/Ks比值升高，提供了需通过基于密码子的选择检验进一步验证的初步信号。系统发育分析表明珍珠菜属形成具高自举支持值的单系群。此外，L. thyrsiflora与珍珠菜亚属珍珠菜组形成单系群，而非其传统分类位置。最后，分化时间分析提示珍珠菜属于早渐新世（33 Mya）发生多样化。总之，本研究厘清了珍珠菜属内分类群的系统发育位置并鉴定了潜在分子标记，结果提示可能需要基于分子系统发育证据对亚属进行重新分类评估。