《Environmental Microbiology》：Environmental Drivers of Nontuberculous Mycobacteria in Tropical Freshwater Systems
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尽管微生物多样性在环境和尺度层面仍很大程度上未被探索，但微生物生物地理学受土壤和生态驱动因素塑造，且微生物群落组成的变化常与宿主群落结构和健康相关联。非结核分枝杆菌（Nontuberculous Mycobacteria, NTM）是具有机会性致病潜力的环境微
尽管微生物多样性在环境和尺度层面仍很大程度上未被探索，但微生物生物地理学受土壤和生态驱动因素塑造，且微生物群落组成的变化常与宿主群落结构和健康相关联。非结核分枝杆菌（Nontuberculous Mycobacteria, NTM）是具有机会性致病潜力的环境微生物的典型代表。然而，对其在热带淡水环境中的多样性和分布的认识仍然有限，而这些知识对于预测疾病出现和传播至关重要。本研究旨在：（i）识别影响法属圭亚那NTM多样性和分布的微生境非生物和生物驱动因素；（ii）比较法属圭亚那和科特迪瓦之间NTM的多样性和分布；（iii）检验不同环境背景下分枝杆菌群落之间的共现关系。通过部署基于环境DNA（eDNA）的宏条形码方法对热带淡水生态系统进行研究，研究人员提出NTM的多样性和分布主要受栖息地类型（城市vs.农村）、样本类型（水vs.沉积物）以及局部非生物因素如沉积物中磷水平（具有物种特异性效应）的驱动。此外，研究人员发现分枝杆菌的分布根据沉积物质地（细粉砂vs.粗砂）和深度呈现分层特征。总体而言，研究人员提出其生态相互作用可能发生在微生境层面，而非遵循明确的生物地理格局。
**研究背景与意义**
人为压力包括气候变化、森林砍伐、集约化农业和城市扩张是生物多样性变化和微生物群落组成转变的关键驱动因素，最终影响传染病的出现。在生态学理论中，生物多样性被认为是生态系统恢复力的基础，并已被假设可通过"稀释效应"减轻传染病风险，尽管这一观点仍存在争议。热带淡水生态系统充分体现了这些动态过程，例如森林砍伐驱动的水生食物网改变减少了顶级鱼类捕食者，有利于携带溃疡分枝杆菌（Mycobacterium ulcerans，引起Buruli溃疡的病原体）的低营养级类群增殖，从而增加人类暴露风险。非结核分枝杆菌（NTM）是具有机会性致病潜力的环境微生物的典型例子，广泛分布于各类生态系统中，包括自然水体、饮用水系统、土壤、水族馆、水产养殖水库和废水等。其中鸟分枝杆菌复合群（Mycobacterium avium complex, MAC）是最常涉及人类感染的NTM，可引起儿童淋巴结炎、老年人呼吸道感染和免疫功能低下者的播散性疾病。然而，尽管NTM具有重要的健康和经济影响，关于其在热带淡水环境中多样性和分布的实证数据仍然有限。理解非生物因素（理化参数、粒度分析）和生物因素（大型动物区系）在塑造其生物地理格局中的作用对于预测疾病出现和传播至关重要。本研究旨在：（1）识别影响NTM多样性和分布的微生境非生物驱动因素（pH、氧气、电导率、温度、磷、氮、碳、C/N比、底物）；（2）评估水生大型生物多样性在塑造NTM格局中的作用；（3）比较跨大陆的NTM多样性和分布；（4）检验分枝杆菌物种之间的相关网络。
**关键技术方法**
本研究采用基于eDNA的宏条形码（metabarcoding）方法，从法属圭亚那（FG）13个水生站点（8个城市、5个农村）和科特迪瓦（CI）12个城市或城郊水体采集水样和沉积物样品。水样通过0.45 μm VigiDNA过滤胶囊过滤后提取DNA；沉积物样品使用PowerSoil DNA提取试剂盒提取DNA；另从FG四个城市站点采集沉积物柱状样进行分层分析。研究设计了22组特异性引物靶向Corynebacteriales目16S rDNA，经in silico验证后选定MycoF/MycoR引物对进行扩增和Illumina MiSeq双端测序。同时采用TaqMan qPCR靶向IS2404和KR基因检测产分枝内酯分枝杆菌（MPM）。水生无脊椎动物采用抄网采集并鉴定至科级。生物信息学分析使用OBITools软件包，以97%相似性阈值定义分子操作分类单元（MOTU）。统计分析包括α多样性（Shannon指数）、β差异性（Jaccard指数、PERMANOVA）、NMDS、层次聚类分析（HCA）、主成分分析（PCA）、线性判别分析（LDA）、随机森林（RF）、共现网络分析和共惯性分析（CoIA）。
**研究结果**
**法属圭亚那淡水生境中分枝杆菌MOTU的多样性和分布**
城市vs.农村站点：HCA将站点分为城市和农村聚类，PERMANOVA显示城乡因素高度显著（F=6.18; p=0.0005, n=24），解释21.9%的总组成方差（R2=0.219）。PCA揭示城乡站点间MOTU组成差异明显：M. shigaense（Shig）、M. haemophilum（Haem）和Myco_group4（Gp04）主要与农村站点相关，而Myco_group6（Gp06）、M. vanbaalenii（Vanb）和MAC（Gp13）主要存在于城市环境。LDA分类准确率达89%。城市站点内部HCA识别出四个聚类，PERMANOVA显示高度显著效应（F=4.49; p=0.0005, n=14），解释57.4%的方差（R2=0.574）。
水vs.表面沉积物样品：α多样性（Shannon指数）在城乡之间或水/沉积物之间无显著差异，但表面沉积物中MOTU数量显著高于水样（t检验, p<0.001）。
MOTU的垂直分布：四个FG站点沉积物柱样分析显示，MOTU丰富度在沉积深度间无显著差异（ANOVA, p=0.744），但站点间差异显著（Kruskal-Wallis, p=0.002）。HCA将站点分为Cay3/Cri2和Amec/Remi两个聚类。M. pallens（Pall）和M. haemophilum（Haem）偏好Amec/Remi，而MAC（Gp13）在Cay3/Cri2中更为丰富。LDA识别Gp13、Pall和沉积物磷（P）为站点组间的关键判别变量（准确率=0.87）。
MOTU分布的非生物驱动因素：大多数非生物参数无显著影响，但城市站点pH倾向较高。MAC（Gp13）、Vanb和Js62与磷呈正相关（p<0.05），而Pall和Haem呈负相关（p<0.05）。RF分析识别Pall、Haem和细粉砂为区分Amec/Remi与Cay3/Cri2的关键变量。MOTU Gp01、Diox和Gilv以及细砂区分0-5 cm和5-10 cm层，均在上层更为普遍。
MOTU分布的生物驱动因素：无脊椎动物和分枝杆菌的α多样性在城乡间无显著差异。共惯性分析（CoIA）显示RV系数为0.33，表明两个数据集之间相关性较弱，暗示分枝杆菌MOTU的分布不依赖于特定无脊椎动物群落的存在。
FG和CI分枝杆菌多样性和分布比较：FG检测到的MOTU数量高于CI（ANOVA, p<0.001），两个地区沉积物中MOTU均多于水样。PCA显示CI群落与FG城市站点相似（除城郊站点外）。RF分析识别Shig为两个国家城乡站点间最强判别因子。
潜在致病性分枝杆菌的分布：研究检测到多种已知人类致病分枝杆菌物种或可能包含致病菌的MOTU。MPM复合群（包括M. marinum、M. ulcerans和M. liflandii）在FG仅两个站点以低流行率检出，在CI的eDNA分析中未检出。相比之下，MPM qPCR检测在FG三个站点呈阳性，在CI沉积物样品中100%阳性。M. gilvum在FG和CI所有栖息地类型中广泛存在且流行率高。
分枝杆菌MOTU共现模式：城市站点MOTU共现比农村站点更多更强，表面沉积物中比水或沉积物柱样中更明显。FG城市站点中显著正共现包括Gp04-Colo、Gp03-Myco、Haem-Rhod等。仅少数MOTU频繁参与共现，如M. rutilum（Ruti）、M. haemophilum（Haem）、M. immunogenum（Immu）、M. gilvum（Gilv）和M. simiae（Simi）。
**讨论与结论**
本研究通过高通量测序鉴定了39/42个分枝杆菌物种或物种群（MOTU），包括潜在人类病原体，证明其环境结构似乎由作用于微生境层面的选择压力塑造。在FG中，分枝杆菌群落组成在城市和农村站点之间、水和沉积物样品之间以及不同沉积深度之间存在差异，表面沉积物中MOTU丰富度高于水柱。沉积物为微生物持久存在和生物膜形成提供了更稳定的环境。磷和底物类型（粉砂vs.粗砂）是FG分枝杆菌群落结构的重要非生物因素。FG和CI城郊站点之间共享分枝杆菌MOTU，表明这些群落并非特定于某一地区或国家，而是局部环境因素而非严格的生物地理屏障驱动了群落结构。共现网络分析揭示城市环境促进了分枝杆菌MOTU之间的共现，城市沉积物基质提供了更有利于微生物联合体形成的结构化环境。研究结果未显示分枝杆菌群落与无脊椎动物群落之间的明确联系，但这并不必然意味着两个群落之间缺乏显著的生态相互作用。研究揭示了多种致病分枝杆菌在热带水和沉积物样品中的广泛存在，包括MAC（Gp13）、M. haemophilum、M. simiae和M. immunogenum，引发了对人类和动物暴露风险的关注。MPM复合群在环境中的低流行率与其在CI沉积物qPCR检测中的高阳性率之间的差异，提示Buruli溃疡致病菌的传播动态可能涉及复杂的生态储库或未被检测到的扩增宿主。eDNA宏条形码在评估微生物物种多样性方面非常成功，但隐蔽微生物物种可能未被检测到，而靶向特定物种的qPCR方法在识别这些隐蔽病原体方面似乎更有效。
结论部分：本研究通过证明栖息地类型、非生物因素和潜在微生物生态相互作用对分枝杆菌分布的影响，推进了对环境分枝杆菌生态学的理解。从淡水环境中潜在检测到多种致病物种表明，在特定环境条件下这些病原体可能出现，进一步强调了环境储库在分枝杆菌疾病出现和传播中的重要性。未来研究应侧重于整合宏基因组学和功能分析以阐明分枝杆菌在淡水生态系统中的生态角色及其潜在的公共卫生意义。纳入气候变异性和土地利用变化的纵向研究也可能为分枝杆菌多样性的环境驱动因素及其与人畜共患疾病出现的相关性提供进一步见解。
