单卵双生子来源的Gαo1K278del突变人诱导多能干细胞衍生皮层神经元揭示GNAO1相关脑病致病机制

《Epilepsia》：Human induced pluripotent stem cell-derived cortical neurons from monozygotic twins with the Gαo1K278del mutation reveal disease mechanisms relevant to GNAO1-related encephalopathy

　　

目的：GNAO1的罕见新发变异可导致以早发性癫痫、运动异常和全面发育迟缓为特征的严重神经发育障碍。已发现超过100种GNAO1致病性变异，并依据其蛋白质特征分为四组。多数致病性变异同时影响GNAO1的两种异构体，而约20%的患者携带GNAO1A特异性变异。即使携带相同变异的患者，其治疗反应也以高度可变著称。本研究旨在利用携带Gαo1K278del变异的单卵双生子来源的人诱导多能干细胞（hiPSCs）构建GNAO1A相关脑病模型，并借助其相同的基因组背景，揭示有助于深入理解该疾病潜在缺陷的表型特征。 方法：研究人员从两名出生后2天即出现癫痫发作的单卵双生子中，获得了表达GNAO1A c.832_834delAAG；p.K278del变异（即Gαo1K278del）的hiPSCs。对每一名双生子，均将携带Gαo1K278del的细胞系与经CRISPR-Cas9修复的同基因对照hiPSC细胞系分别诱导分化为神经祖细胞（NPCs），继而分化为皮层神经元，并分析变异特异性的转录组学、形态学和电生理学特征。 结果：携带Gαo1K278del突变的hiPSC衍生NPCs表现出神经玫瑰花结结构紊乱，并呈现转录组改变。在皮层神经元中，Gαo1K278del变异导致树突尺寸和复杂度降低，同时伴突触前和突触后斑点增多。多电极阵列（MEA）记录显示皮层神经元爆发活动模式异常，表现为爆发次数减少而每次爆发的棘波数增多。抗癫痫药物左乙拉西坦降低了来自两名患者的皮层神经元的棘波频率和每次爆发的棘波数。 意义：所建立的GNAO1A hiPSC衍生体外模型揭示了GNAO1相关脑病的关键结构和功能特征。两名双生子神经元中相似的体外表型，凸显了hiPSC衍生模型在研究GNAO1相关脑病分子机制及治疗干预效果方面的实用性。

研究背景：GNAO1编码G蛋白α_o亚基，负责转导G蛋白偶联受体（GPCRs）信号。其罕见新发变异可导致发育性及癫痫性脑病17（DEE17；OMIM #615473）或伴不自主运动的神经发育障碍（OMIM #617493），具体取决于首发临床表型。癫痫与运动障碍常伴发育迟缓，许多符合DEE描述的患者在生命后期出现运动障碍。GNAO1存在GNAO1A和GNAO1B两种异构体，分别编码Gα_o1和Gα_o2。约三分之一的致病性变异导致早发性癫痫，GNAO1A是最主要的致病异构体，而GNAO1B的作用尚不明确。即使携带相同变异，患者表型和药物反应也差异显著。目前该病的病理生理机制仍知之甚少，Gα_o通过负向调控钙、钾通道及释放Gβγ伙伴来调节神经元兴奋性和突触传递。既往研究多采用体外GTP酶活性测定或在哺乳动物细胞系中过表达融合蛋白，揭示了变异对蛋白功能、相互作用、稳定性和定位的广泛影响，但尚不清楚这些变异在相关细胞类型的生理水平上如何促成特定表型。动物模型的可转化性有限，仅Gα_o^G203R变异在多种动物模型中被研究，无脊椎动物模型显示运动异常而无癫痫样活动，小鼠模型表现为围产期致死而无癫痫活动证据。hiPSCs可克服动物模型的部分局限，已在SCN2A、STX1BP1、SCNA8A等DEE基因中成功建模；就GNAO1而言，仅Gα_o^G203R变异曾用hiPSCs建模，显示NPC神经玫瑰花结排列紊乱、神经元活动降低、极性异常及无法建立同步神经环路。因此，研究人员利用携带Gα_o1^K278del变异的单卵双生子hiPSCs，建立GNAO1A相关脑病的体外模型，以探究变异驱动的疾病机制并筛选治疗药物。

研究内容与结论：研究人员从两名出生后2天出现新生儿癫痫的单卵双生子（患者A和患者B）皮肤成纤维细胞重编程获得hiPSC细胞系，并通过CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物同源定向修复（HDR）构建同基因修复对照，将突变与修复细胞系分化为NPCs和皮层神经元，进行转录组、形态学和电生理分析。结果显示，Gα_o1^K278del被归类为IV组功能丧失性变异并伴显性负性成分；突变NPCs出现神经玫瑰花结结构紊乱及转录组异常；皮层神经元表现出树突缩短、分支减少、突触前后斑点增多及异常爆发模式；左乙拉西坦可降低突变神经元的棘波频率和每次爆发的棘波数。研究人员认为，该模型揭示了GNAO1相关脑病的关键结构和功能特征，两名双生子神经元相似的体外表型凸显了hiPSC衍生模型在研究分子机制和治疗干预效果方面的实用性。

关键技术方法：研究人员采用Sendai病毒介导重编程从两名单卵双生子患者皮肤成纤维细胞建立hiPSCs（样本来源为携带GNAO1 c.832_834delAAG；p.Lys278del变异的单卵双生子）；利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物联合单链寡脱氧核苷酸进行同源定向修复构建同基因对照；采用双SMAD抑制（SMADi）和拟胚体形成诱导NPCs，再用前脑神经元分化试剂盒分化为皮层神经元；通过RNA测序（RNAseq）进行转录组分析；采用免疫荧光结合NeuronJ和Find Maxima进行形态学与突触斑点定量；利用多电极阵列（MEA）记录神经电活动并进行药物评估。

研究结果：

3.1 携带GNAO1 c.832_834delAAG；p.K278del变异的单卵双生子患者表现为早发性癫痫：女性单卵双生子于37+5周出生，出生后2天均出现新生儿癫痫并接受苯巴比妥治疗；全基因组分析显示GNAO1A存在c.832_834delAAG缺失，导致Gα_o1第278位赖氨酸缺失。患者B癫痫经苯巴比妥控制，患者A癫痫复发；8岁时两名患者均出现痉挛和肌张力障碍。

3.2 致病性Gα_o1^K278del被归类为IV组变异：通过AlphaFold 3建模显示，Lys278位于Ras样GTPase结构域的螺旋αG，与开关III区（swIII）的Asp232形成约3.4 ?的稳定相互作用，缺失预计扰动局部堆积并影响GDP结合与伙伴结合。BRET实验显示突变体基础生物发光降低，且组胺刺激下未能解离异源三聚体；突变体主要定位于细胞质而少见于质膜；转染后2天突变蛋白水平急剧下降，与已验证的IV组变异Gα_o1^S229R相当，且为转录后调控，在神经母细胞瘤TR14细胞中差异更明显。上述特征将Gα_o1^K278del归为IV组变异。

3.3 Gα_o1^K278del hiPSC衍生NPCs玫瑰花结结构紊乱：研究人员建立双生子来源突变hiPSCs并经CRISPR-Cas9修复，所有细胞系均具多能性且基因组稳定。NPCs中GNAO1B转录本平均为GNAO1A的4.23倍，但突变NPCs仍出现神经玫瑰花结结构紊乱，而同基因修复细胞形成极性良好的顶端朝向玫瑰花结，提示该形态表型为Gα_o1特异或Gα_o1变异对总Gα_o蛋白池具有显性效应。

3.4 Gα_o1^K278del NPCs转录组富集GPCR信号与神经发育过程：对PAX6阳性NPCs行RNAseq，排除X连锁基因后鉴定出478个差异表达基因（DEGs；FDR<0.05），其中210个下调、268个上调，涉及Gα功能与信号（GNG2、GNG4、RGS5、ADGRA1）、神经元功能（SCN3B、CACNA1C、SLCA2、GABRB3）和神经发育（WNT3A）。基因本体（GO）富集分析显示钠通道活性抑制、神经系统发育和神经元投射显著富集；Ingenuity通路分析显示GABA能、谷氨酸能和阿片受体信号增强，Wnt/β-catenin预测受抑制，突触发生和cAMP反应元件结合蛋白（CREB）信号预测激活；反卷积分析显示突变与对照NPCs中神经元和星形胶质细胞比例相似。

3.5 Gα_o1^K278del降低皮层神经元复杂度并增强突触终末形成：体外培养50天（DIV50）时，突变与对照神经元原代树突数量相似，但突变神经元树突长度显著缩短、分支点数量显著减少、分支复杂度持续降低；突触前（synaptophysin）和突触后（Homer1）终末斑点增多，但重叠的假定功能性突触总数未见增加。患者A的二级分支点复杂度与对照相似，而患者B不同。

3.6 Gα_o1^K278del皮层神经元产生异常爆发模式：MEA纵向记录显示，自DIV21起突变与对照神经元棘波和爆发频率均随成熟逐渐增加；两组棘波频率相似，但突变培养物爆发频率持续降低，每次爆发的棘波数逐渐增加而对照保持稳定，爆发内棘波频率显著升高，爆发持续时间略有增加但未达统计学显著。总体表现为爆发频率降低、每次爆发棘波数增多而总棘波频率不变。

3.7 左乙拉西坦降低Gα_o1^K278del皮层神经元活动：在培养第55天给予10 mmol·L^?1左乙拉西坦后，突变与对照神经元棘波频率均立即下降，但对照降幅可忽略；两组爆发频率和爆发持续时间较基线无变化，患者A神经元爆发持续时间在用药后下降；突变神经元每次爆发的棘波数明显减少而对照无此效应，患者B爆发内棘波频率显著下降；洗脱后棘波频率和每次爆发棘波数迅速恢复至基线，提示药物作用可逆。

讨论部分总结：研究人员利用单卵双生子来源hiPSCs建模罕见的GNAO1新生儿癫痫变异c.832_834delAAG；p.K278del，并将其归类为IV组变异。该细胞系组合的独特性在于来源于出生后不久即出现癫痫的单卵双生子，且该变异仅影响被视为主要致病异构体的Gα_o1。与既往唯一建模的Gα_o^G203R变异相比，两者特征不同，但神经玫瑰花结紊乱表型相当，转录组在Wnt信号抑制方面部分重叠，提示尽管Gα_o1 mRNA表达低约四倍，其功能障碍仍足以在NPCs中产生GNAO1特异性表型。数据支持功能丧失机制，但单倍剂量不足变异临床表型较轻，提示Gα_o1^K278del具有更明显的显性作用，同时不能排除单倍剂量不足与其他机制共同作用。转录组中RGS1和RGS5下调、GNG2和GNG4上调，可能是对Gα_o信号减弱的反馈反应。树突长度和分支复杂度降低与Wnt/β-catenin下调及Rho GTPase调控的细胞骨架重塑一致。异常爆发特征与STXBP1、KCNQ2变异hiPSC衍生神经元的部分表型相似。左乙拉西坦可调节突变神经元网络活动并改善变异特异性效应，但缺乏临床单药治疗数据，无法将细胞学发现外推至体内；MEA方法缺乏单细胞分辨率且通量有限，无法评估静息膜电位、离子通道行为或单突触事件，未来需结合膜片钳等技术。研究聚焦于皮层谷氨酸能神经元，鉴于GNAO1致病机制也与皮层下基底神经节环路相关，研究基底神经节各类神经元及纹状体-皮层环路中该变异的作用将有助于理解疾病；基于双生子对苯巴比妥的反应，研究其对K278del GABA能中间神经元和投射神经元的作用是合理方向。两名双生子神经元中观察到相似但不完全相同的趋势，鉴于其癫痫和运动障碍起病相似，转录组、结构和电生理的相似性凸显hiPSCs是GNAO1相关脑病的稳健体外模型，该模型将有助于揭示疾病机制并提供治疗药物筛选平台。

结论部分译文：所建立的GNAO1A hiPSC衍生体外模型揭示了GNAO1相关脑病的关键结构和功能特征。两名双生子神经元中相似的体外表型，凸显了hiPSC衍生模型在研究GNAO1相关脑病分子机制及治疗干预效果方面的实用性。