cNORSE患者免疫治疗暴露相关的血清与脑脊液细胞因子动态变化

《Epilepsia》：Longitudinal serum and CSF cytokine dynamics in NORSE: Associations with immunotherapy exposure

　　

目的：旨在表征隐源性新发难治性癫痫持续状态（cNORSE）中，根据免疫治疗暴露情况分析的血清与脑脊液（CSF）细胞因子动态变化。方法：研究人员分析了来自29例和14例cNORSE患者的94份血清和42份CSF样本的细胞因子谱。其中9例患者同时提供了两种样本类型，共计34例患者。样本根据免疫治疗暴露情况分为未接受免疫治疗（NT）、一线治疗（FL）和二线治疗（SL），并按固有免疫或适应性免疫导向治疗进行分层。SL代表累积暴露，因为所有SL样本均在FL和SL治疗启动后采集。线性混合效应模型考虑了重复测量和距cNORSE发病的时间。系统性文献综述纳入了27项研究和63例患者。结果：血清细胞因子水平在FL期间（n=24）通常低于NT期间（n=9），而大多数细胞因子在SL期间（n=61）高于FL期间。CXCL8（C-X-C基序配体8）/IL-8和CCL2（C-C基序趋化因子配体2）在SL期间高于FL期间，其中CCL2在多重检验校正后仍具有统计学显著性。当分析限制在发病后7-30天采集的样本时，未观察到血清差异仍具有统计学显著性。CSF细胞因子水平在FL期间（n=10）和SL期间（n=25）通常低于NT期间（n=7）。固有免疫导向治疗与较高的血清IL-6、CXCL8/IL-8和CCL2以及CSF IL-4相关，而适应性免疫导向治疗与较低的CSF MIP-1α（巨噬细胞炎性蛋白-1α）相关。排除托珠单抗治疗患者后，与较高血清IL-6的关联不再观察到。SL启动或癫痫持续状态缓解后的时间关联在多重检验校正后均未保持统计学显著性。文献综述显示，免疫治疗启动后CSF中促炎细胞因子降低的频率高于血清。意义：cNORSE中的细胞因子谱因治疗暴露和 compartment 而异。SL期间持续的血清炎症可能反映疾病严重程度、全身性炎症、治疗效应或其综合作用，而CSF在免疫治疗暴露后显示更一致的降低。这些发现强调了在解读细胞因子测量时治疗时机和 compartment 的重要性，并支持整合基线免疫表型和标准化临床结局的前瞻性研究。

研究背景：新发难治性癫痫持续状态（NORSE）及其伴有前驱发热的亚型——发热感染相关癫痫综合征（FIRES），是癫痫持续状态（SE）中最严重的形式之一，发生于无活动性癫痫或既往神经系统疾病的成人和儿童中，且在SE发病后最初数天内无可识别的急性中毒性、结构性或代谢性病因。尽管进行了广泛的诊断检查，超过50%的病例在出院时仍无法确定病因，被归类为隐源性NORSE（cNORSE）。这些患者常经历最难治的SE，需要长时间的ICU住院、多种抗癫痫药物（ASMs）以及频繁的多种连续麻醉药物。结局仍然不佳，约20%的患者在急性期死亡，许多幸存者出现显著的神经认知后遗症、生活质量受损和慢性药物难治性NORSE后癫痫。过去十年中，越来越多的证据支持免疫失调在cNORSE中的核心作用，尤其是细胞因子通路激活，为靶向免疫治疗提供了依据，这反映在2022年NORSE管理国际共识建议中。多项研究表明，cNORSE患者与对照组相比，尤其是与已知病因的难治性SE患者相比，细胞因子水平升高，特别是固有免疫激活标志物。较高的细胞因子浓度也与较差的短期和长期功能结局以及更严重的神经影像学异常相关。然而，炎症反应在患者间呈现异质性，这可能部分解释了免疫治疗反应的不均一性。研究人员此前使用扩展的96重细胞因子面板，识别出cNORSE的三个生物学上不同的聚类，分别以无炎症特征、固有免疫激活或自身免疫失调为特征。这种异质性提示细胞因子谱可能有助于指导精准免疫治疗。然而，大多数现有研究依赖于在SE发病后不同时间采集的多中心生物标本。因此，许多患者在样本采集前已接受免疫调节治疗，包括一线和二线治疗。例如，在研究人员最近的聚类研究中，74%的患者在采样前至少接受过一种一线免疫治疗，19%接受过二线治疗。这些治疗对细胞因子浓度的影响仍知之甚少。研究人员旨在表征一个国际队列中根据免疫治疗暴露情况分析的血清和CSF细胞因子动态变化，并结合系统性文献综述。

研究人员开展了什么研究及主要结论：研究人员开展了一项国际多中心回顾性队列研究，分析了34例cNORSE患者的94份血清和42份CSF样本，根据免疫治疗暴露时期（NT、FL、SL）和免疫治疗类别（固有免疫导向 vs 适应性免疫导向）分析11种细胞因子的纵向动态变化，并结合系统性文献综述（27项研究，63例患者）进行验证。主要结论为：CSF促炎细胞因子在免疫治疗暴露后总体趋于降低，而血清细胞因子动态更为复杂；血清CCL2和CXCL8/IL-8在SL后高于FL，但限制在发病后7-30天样本时差异不再显著，提示无法与疾病时机分离；固有免疫导向治疗与较高的血清IL-6、CXCL8/IL-8和CCL2以及CSF IL-4相关，适应性免疫导向治疗与较低的CSF MIP-1α相关；排除托珠单抗治疗患者后，血清IL-6关联不再显著。这些发现的重要意义在于：强调了治疗时机和 compartment 在解读细胞因子测量中的重要性，血清和CSF提供互补而非可互换的信息，支持在可行时同时采集两个 compartment 的样本，并为未来整合基线免疫表型和标准化临床结局的前瞻性研究提供了依据。

关键技术方法：研究人员采用线性混合效应模型分析纵向细胞因子数据，将细胞因子水平作为因变量，治疗时期或免疫治疗类型作为主要固定效应，距SE发病的采样延迟作为协变量，患者标识符作为随机截距，使用Type III方差分析（ANOVA）检验全局效应，并通过emmeans包获取估计边际均值和Tukey校正的成对比较；采用Kruskal-Wallis检验及Dunn事后检验进行非参数组间比较；使用Benjamini-Hochberg方法进行错误发现率校正；对随访样本与基线样本的细胞因子变化进行计算；采用Wilcoxon符号秩检验进行配对分析；使用Spearman秩相关评估时间关联；通过多重荧光珠基免疫分析方法检测11种细胞因子；并进行系统性文献综述（PROSPERO注册号CRD420261395810），检索PubMed数据库2001年至2026年5月13日发表的文献。样本来源：耶鲁NORSE/FIRES生物样本库和巴黎Pitié-Salpêtrière医院COLETTE生物样本库。

研究结果：

3.1 前瞻性研究参与者：截至2026年3月30日，耶鲁NORSE/FIRES或COLETTE生物样本库共纳入213例NORSE患者，其中184例为cNORSE，167例采集了急性期样本。158例患者进行了血清细胞因子测量，114例进行了CSF测量。64例患者有连续血清样本，其中29例在至少两个不同治疗时期（NT、FL或SL）采集了样本。33例患者有连续CSF样本，其中14例在至少两个不同治疗时期采集了样本。9例患者同时有连续血清和CSF样本，共计纳入34例患者。其中10例患者此前已在研究人员的细胞因子文章中发表。94份血清样本来自29例cNORSE患者（中位年龄26岁，范围3-87；19例男性，7例儿童，24例FIRES），中位每人3份样本。样本分布：NT期9份（SE发病后中位3天采集），FL期24份（一线治疗启动后中位5天，SE发病后中位9天采集），SL期61份（一线治疗启动后中位32天，二线治疗启动后中位24天，SE发病后中位36天采集）。除2例外所有有血清样本的患者均接受了二线免疫治疗。42份CSF样本来自14例cNORSE患者，其中9例有配对血清样本。中位年龄28岁（范围3-67；5例男性，4例儿童，13例FIRES），中位每人2份样本。样本分布：NT期7份（SE发病后中位0天采集），FL期10份（一线治疗启动后中位4天，SE发病后中位7天采集），SL期25份（一线治疗启动后中位45天，二线治疗启动后中位29天，SE发病后中位43天采集）。除3例外所有有CSF样本的患者均接受了二线免疫治疗。

3.2 细胞因子水平跨治疗时期的演变：在血清中，FL期细胞因子水平通常低于NT期，而大多数细胞因子在SL期高于NT期。NT相关比较应谨慎解读，因为FL vs NT仅有3例患者提供配对观察，SL vs NT有4例。血清中配对观察最多的是SL vs FL比较（20例患者）。相对于FL，SL样本显示CXCL8/IL-8（p=0.013）和CCL2（p<0.001）水平较高，仅CCL2在多重检验校正后仍显著（校正p=0.028）。在限制于SE发病后7-30天采集样本的敏感性分析中，治疗时期之间的任何成对倍数变化均未保持显著。在CSF中，FL和SL期细胞因子水平通常低于NT期，尤其是促炎细胞因子。NT相关比较同样受限于配对观察数量少（FL vs NT为2例，SL vs NT为3例）。SL vs FL比较有7例患者提供配对观察。置信区间较宽，FL与SL之间的差异在多重检验校正后均未保持显著。排除IT-DEX给药后采集的CSF样本的敏感性分析显示类似总体发现，表明观察到的CSF细胞因子变化并非仅由直接鞘内皮质类固醇暴露驱动。

3.3 根据靶向免疫治疗暴露的炎症生物标志物谱：在94份血清样本中，33份（35%）在暴露于固有免疫或适应性免疫导向治疗之前采集（N），37份（39%）在仅固有免疫导向治疗后采集（I），14份（15%）在仅适应性免疫导向治疗后采集（A），10份（11%）在两类治疗均暴露后采集（I+A）。CCL2（Kruskal-Wallis p<0.001）和CXCL8/IL-8（p=0.0051）在各组间存在差异。与N样本相比，固有免疫导向治疗期间或之后采集的样本中CCL2和CXCL8/IL-8水平较高，两类治疗均暴露后采集的样本中最高（Dunn事后检验，两项比较vs N均p<0.001）。在线性混合效应模型中，与未暴露于固有免疫导向治疗的患者样本相比，固有免疫导向治疗期间或之后采集的样本显示较高的血清IL-6（校正p=0.039）、CXCL8/IL-8（校正p=0.010）和CCL2水平（校正p=0.0064）。多重检验校正后无其他关联保持显著。排除托珠单抗启动后采集样本的敏感性分析中，Kruskal-Wallis得出类似结果。然而在线性混合效应模型中，IL-6关联不再显著（p=0.51），而CXCL8/IL-8在固有免疫导向治疗暴露后仍较高（校正p=0.026），CCL2显示类似趋势（校正p=0.051）。在42份CSF样本中，17份（40%）在N期采集，12份（29%）在I期，4份（10%）在A期，9份（21%）在I+A期。IL-6（p=0.033）和IL-4（p=0.024）在各组间存在差异。未治疗（N）样本IL-6水平高于I和I+A样本（校正p=0.019），而I样本IL-4水平高于N样本和I+A（校正p=0.0020和p=0.010）。在线性混合效应模型中，固有免疫导向治疗暴露与较高IL-4水平相关（校正p=0.0030）。适应性免疫导向治疗暴露与较低MIP-1α水平相关（校正p=0.0037）。

3.4 血清细胞因子水平的长期变化：11例患者在出院后采集了血清（T2），距SE缓解中位300天（IQR 175-408）。其首个可用样本（基线）在NT期采集4例，FL期采集7例。在配对纵向分析中，T2时IL-6中位水平较低而CCL2较高（未校正p=0.056和p=0.037），但多重检验校正后均未保持显著。同样，T1至T2比较在多重检验校正后均未保持显著，包括限制于8例T1样本在SE缓解后采集患者的敏感性分析。研究人员进一步分析了所有可用的SL和慢性T2期血清样本，根据距SL启动和SE缓解的时间进行分析。较长的SL启动后时间与较低的IL-1β在未校正分析中相关（Spearman p=0.015），但该关联在多重检验校正后未保持显著。无其他时间关联在校正后保持显著。

3.5 根据临床病程的细胞因子水平演变：在血清中，65份随访样本中45份来自分类为改善的患者，7份为稳定，13份为恶化。与基线样本相比，恶化患者显示较高的CXCL8/IL-8（校正p=0.018）和CCL2水平（校正p=0.042），IL-1β仅在未校正分析中较高（p=0.018）。稳定患者显示较高的IL-6水平（p=0.028），但该关联在多重检验校正后未保持显著。改善患者相对于基线无显著变化。为进一步研究纵向个体内变化，研究人员计算了每份随访样本相对于相应个体基线值的细胞因子水平变化。与改善患者相比，恶化患者显示IL-17A（校正p=0.0014）和IL-1β（校正p=0.044）升高更明显。在CSF中，细胞因子水平在临床病程分类间经多重检验校正后无关联保持显著，无论是平均值还是变化值。

3.6 文献综述：研究人员识别了27项研究，报告了63例患者在免疫治疗前后测量了细胞因子水平。仅血清测量17例，仅CSF测量21例，两个 compartment 均测量25例。细胞因子测量之间给予的治疗包括皮质类固醇（n=6）、IVIG（n=4）、PLEX（n=2）、阿那白滞素（n=23）、托珠单抗（n=29）、利妥昔单抗（n=4）、IT-DEX（n=18）、托法替尼（n=1）和巴瑞替尼（n=1）。总体而言，文献显示与研究人员队列一致的 compartment 特异性模式，CSF中促炎细胞因子降低的报告频率更高，而血清中轨迹更为异质。阿那白滞素主要与血清和/或CSF IL-1RA水平升高相关，如药效学预期，并与多种CSF细胞因子降低或正常化相关，包括IL-6和CXCL8/IL-8。相反，血清对阿那白滞素的反应从选定细胞因子降低或正常化到无明显变化不等，也有报道包括IL-6和CXCL8/IL-8在内的某些细胞因子短暂升高。两项研究报告阿那白滞素后IL-1β正常化。托珠单抗给药后常伴随CSF IL-6水平降低，而血清IL-6显示可变轨迹，包括治疗后矛盾性升高。这些异质性血清发现与研究人员观察到的固有免疫导向二线免疫治疗暴露期间或之后采集样本中血清IL-6和CXCL8/IL-8水平较高相平行。已发表的CCL2纵向数据较为有限，有报道阿那白滞素治疗期间血清和CSF CCL2降低，以及利妥昔单抗后CSF CCL2水平降低。近年来，若干病例报告和小型病例系列探索了IT-DEX对细胞因子谱的影响，进一步说明细胞因子动态的变异性。早期研究报告CSF和血清细胞因子水平均降低。然而，后续报道也描述了IT-DEX后短暂细胞因子升高，被假设反映皮质类固醇给药诱导的化学性脑膜炎而非NORSE恶化或治疗失败。

讨论部分总结：在这项研究中，研究人员调查了NORSE患者根据免疫治疗暴露的纵向细胞因子动态。主要发现为：一线免疫治疗启动后，血清和CSF中炎症细胞因子总体降低。然而，接受二线治疗的患者观察到血清细胞因子水平升高，而CSF细胞因子在二线治疗启动后倾向于保持稳定或继续降低。需要升级至固有免疫和适应性免疫导向联合治疗的患者血清细胞因子水平最高。文献综述观察到类似的细胞因子动态。与NT期相比，FL后采集的血清和CSF样本显示多种固有炎症介质水平较低。大多数患者接受了糖皮质激素，已知可诱导细胞因子表达的早期降低。相反，接受SL的患者血清细胞因子水平较高。具体而言，固有免疫导向治疗期间或之后采集的样本显示固有炎症标志物水平较高，尤其是IL-6、CXCL8/IL-8和CCL2，最终需要固有免疫和适应性免疫联合导向治疗的患者中水平最高。当分析限制于托珠单抗启动前采集的样本时，IL-6关联不再显著，而CXCL8/IL-8关联持续存在，CCL2关联减弱。尽管该敏感性分析纳入样本较少，但该发现提示主要队列中观察到的较高IL-6水平可能部分与托珠单抗暴露相关而非仅反映更强的炎症活动。这些发现可能看似矛盾，因为固有免疫导向治疗专门针对此类介质。若干假设可解释这些观察，包括适应证偏倚、药物诱导的细胞因子变化、全身性感染、ICU住院相关炎症反应或需要SL治疗患者中更高的疾病严重程度。在27例中仅5例（19%）在SL启动前可获得11重细胞因子面板结果；然而，不能排除适应证偏倚，包括优先对具有更强固有炎症特征的患者使用固有免疫导向治疗。具体而言，托珠单抗可能优先用于血清或CSF IL-6水平升高的患者。固有免疫导向治疗在其他炎症性疾病中也与矛盾性细胞因子升高相关。例如，在类风湿关节炎和健康对照中，托珠单抗给药后已有血清IL-6水平升高的报道，归因于IL-6受体阻断损害IL-6清除直至受体可用性恢复。类似地，在NORSE中，已有托珠单抗启动后血清IL-6水平升高的描述。另一个可能的解释是SL治疗通常用于最治疗难治和临床最严重的患者。尽管主要分析已对采样延迟进行调整，但治疗时期之间有限的时间重叠阻止了治疗暴露与疾病时机的完全分离。确实，当分析限制于SE发病后7-30天采集的样本时，治疗时期之间的任何成对倍数变化均未保持显著。因此，主要分析中SL期间观察到的较高细胞因子水平不能独立于疾病时机归因于治疗暴露。较晚的SL样本也可能识别疾病更延长和严重的患者，因而全身炎症负荷更大，尽管由于缺乏详细的纵向疾病严重程度测量，无法直接检验。研究人员的纵向分析还显示随着SL启动后时间增加，IL-1β水平呈下降趋势，尽管该关联在多重检验校正后未保持显著。研究人员的研究发现和既往研究表明，血清细胞因子可能反映原发性免疫失调、持续癫痫负荷、神经元损伤和长期危重病相关全身并发症的综合作用。这种复杂性对比于单基因自身炎症性疾病如新生儿起病多系统炎症性疾病（NOMID），其中细胞因子升高更直接反映原发病理通路并在阿那白滞素治疗后正常化。尽管本研究中没有血清样本在记录感染期间采集，但不能排除部分患者在采样前几天经历感染的可能性。因此，疾病病程早期采集的血清可能更好地反映原发性免疫失调，而较晚样本更可能捕获癫痫诱导的炎症变化和全身并发症（包括合并症）。与血清相反，SL期采集的CSF样本中许多炎症介质相对于FL和NT期保持较低。适应性免疫导向治疗暴露后采集的样本显示较低MIP-1α水平，而固有免疫导向治疗暴露后采集的样本相对于未暴露样本显示IL-4水平升高。IL-4通常被认为是Th2相关细胞因子，可能反映CNS内向抗炎免疫通路的转变。CSF采样患者中IT-DEX使用较多可能通过直接皮质类固醇暴露促成这种 compartment 特异性模式。然而，排除IT-DEX给药后采集CSF样本的敏感性分析显示类似总体发现，提示IT-DEX暴露 alone 不能解释CSF细胞因子水平的降低。更广泛地说，这些发现可能反映治疗相关的CNS炎症反应抑制，尽管CSF样本量小和伴随免疫治疗阻止了归因于特定治疗。不能排除免疫治疗延长对CSF细胞因子正常化后患者的潜在获益。同样，这些发现不应被解读为支持扣留二线免疫治疗。血清和CSF反应之间的差异不能用采样时间差异解释，因为SL启动后中位延迟在血清和CSF采集之间相当。既往涉及阿那白滞素和托珠单抗等治疗的研究已报道类似不一致，提示它们可能反映真实的生物学 compartment 化而非方法学偏倚。细胞因子网络是组织依赖性的，不同器官和 compartment 具有不同的调节机制和对免疫治疗的反应。因此，血清细胞因子可能特异性较低且更受整体疾病严重程度和全身炎症负荷影响，而CSF由于解剖上更隔离，可能更好地反映直接发生在CNS内的炎症过程。血脑屏障通透性、免疫治疗的CNS穿透性和鞘内细胞因子动力学的差异也可能促成这些不同轨迹。研究人员可以假设免疫治疗可能有助于减少CNS compartment 的炎症，即使全身炎症信号仍然升高且疾病未得到控制。探索性分析还识别了纵向血清细胞因子变化与同期电临床轨迹之间的关联，而在CSF中经多重检验校正后无关联保持显著。鉴于电临床演变的回顾性分类、异质性采样间隔和治疗强度的潜在混杂，这些发现应谨慎解读。然而，它们支持进一步的前瞻性研究使用标准化EEG和临床严重程度测量来确定纵向细胞因子变化是否提供补充电临床监测的信息。应承认若干局限性。第一，在研究人员的研究队列分析中，研究人员根据固有免疫 vs 适应性免疫导向机制对治疗进行分组，未单独分析特定药物。这种实用性分类不意味着通路特异性，因为某些治疗，特别是皮质类固醇和JAK-STAT抑制剂，对固有免疫和适应性免疫均有影响。此外，研究人员无法区分阿那白滞素、托珠单抗、IT-DEX、利妥昔单抗或环磷酰胺的潜在不同效应。然而，鉴于样本量，此类分析可能统计效力不足。第二，不能排除适应证偏倚，因为临床医生在部分病例中治疗选择前可获取细胞因子结果。第三，尽管对距SE发病延迟进行了调整，样本采集时间仍存在异质性。第四，并非所有患者在全部治疗时期均有样本采集；重复采样未标准化，且仅小部分患者采集了CSF。第五，若干细胞因子有相当比例浓度低于检测限。这些浓度被赋值为零，当大部分测量低于检测限时可能引入偏倚并限制这些分析物定量差异的解读。样本在多个检测批次中分析，未独立确定批内和批间变异系数，限制了量化跨批次分析变异的能力。第六，尽管采集时排除了记录感染，但不能完全排除先前全身炎症事件的贡献。第七，伴随的生酮饮食具有公认的免疫调节效应，可能独立影响细胞因子谱。最后，由于研究的多中心设计，无法获得详细的每日临床严重程度量表，阻止了按该因素调整分析。尽管有这些局限性，研究人员的发现为解读接受治疗的NORSE患者细胞因子谱提供了重要背景，特别是通过强调治疗暴露的影响和血清与CSF中观察到的不同轨迹。未来工作的重要视角是验证观察到的纵向细胞因子动态与同期电临床演变之间的关联，并确定这些动态是否与治疗反应和较长期功能结局相关。在研究人员的文献综述中，细胞因子演变与临床/EEG变化之间的相关性不一致，仅45%的血清和39%的CSF比较呈正一致性，且这种一致性根据接受的免疫治疗显著变化，IT-DEX最低，阿那白滞素和托珠单抗最高。需要更大规模的前瞻性队列和标准化定量结局测量来阐明这些关联。此类研究还应考虑初始免疫亚型，如研究人员此前描述的生物学上不同的cNORSE特征可能 underlying 不同治疗反应和细胞因子轨迹。将细胞因子谱与神经元损伤的其他生物标志物如神经丝轻链结合可进一步帮助区分全身和CNS炎症过程与临床结局。此外，标准化纵向细胞因子谱可能代表未来cNORSE前瞻性登记和干预试验的有价值生物学终点。

研究结论翻译：在这个国际队列中，促炎CSF细胞因子水平在免疫治疗暴露后总体趋于降低，而血清细胞因子动态更为复杂。尽管在总体分析中血清CCL2和CXCL8/IL-8在二线免疫治疗后高于一线免疫治疗后，但当分析限制于SE发病后7-30天采集的样本时未观察到这些差异，表明它们无法与疾病时机分离。这些不同的 compartment 反应，在文献中也有观察到，提示血清和CSF细胞因子提供互补而非可互换的信息，并支持在可行时同时采集两个 compartment 的样本。纵向细胞因子变化与同期电临床轨迹之间的探索性关联进一步支持使用标准化临床和EEG测量的前瞻性评估。未来的前瞻性研究，采用标准化采样、治疗方案和按初始免疫亚型分层的定量纵向临床和EEG测量，将需要确定两个 compartment 的细胞因子测量如何最好地指导NORSE的个性化免疫治疗策略和监测治疗反应。