《United European Gastroenterology Journal》：Anti-TNF Therapy Is Associated With Browning- and Immune-Related Changes in Creeping Fat in Crohn's Disease
编辑推荐：
背景：克罗恩病（CD）中的爬行脂肪（CrF）是一种代谢活跃的病变周围脂肪组织，参与肠道炎症。生物制剂治疗是否改变其棕色化相关表型在很大程度上仍未被探索。研究人员研究了抗TNF治疗是否与CrF中棕色化、线粒体生物合成及免疫相关通路的改变有关，以及体外英夫利西单抗
背景：克罗恩病（CD）中的爬行脂肪（CrF）是一种代谢活跃的病变周围脂肪组织，参与肠道炎症。生物制剂治疗是否改变其棕色化相关表型在很大程度上仍未被探索。研究人员研究了抗TNF治疗是否与CrF中棕色化、线粒体生物合成及免疫相关通路的改变有关，以及体外英夫利西单抗（infliximab）暴露后是否发生类似的分子改变。方法：分析了两个独立的人类队列。（1）观察性队列：分析抗TNF治疗和未接受抗TNF治疗的CD患者（分别为n=14和n=19）的CrF活检样本的代谢和炎症基因及蛋白表达。分离脂肪间充质干细胞（AdMSCs）和成熟CrF来源脂肪细胞，通过免疫组织化学和蛋白质印迹法评估UCP1蛋白丰度。（2）体外队列：将接受手术的未使用抗TNF的CD患者的配对CrF外植体在有或无英夫利西单抗（5 mg/kg等效剂量，24 h）条件下培养，并通过RT-qPCR和免疫组织化学进行分析。结果：抗TNF治疗患者在mRNA和蛋白水平上显示CrF中UCP1表达较高。接受治疗患者的CrF来源成熟脂肪细胞表现出棕色化/产热及线粒体生物合成相关基因表达增加，同时部分促炎标志物降低。AdMSCs的条件培养基蛋白谱也显示出探索性差异，但经FDR校正后无蛋白保持显著。体外英夫利西单抗暴露与部分棕色化、线粒体生物合成及免疫相关标志物的改变相关。讨论：观察性和体外研究结果共同表明CrF是CD中对anti-TNF应答的免疫代谢区室，其特征为协调的棕色化、线粒体生物合成及免疫相关分子改变。需要功能学研究来确定这些改变的代谢意义。
研究背景：克罗恩病（CD）是一种慢性胃肠道炎症性疾病，以透壁性炎症和病变肠段周围增生性肠系膜脂肪组织（MAT）形成为特征，后者通常被称为爬行脂肪（CrF）。CrF是一种代谢和免疫活跃的组织，通过细胞因子、脂肪因子及其他介质参与CD病理生理过程。CrF的一个意外特征是能够获得米色脂肪组织特征。研究人员所在团队首次报道了CD患者CrF中存在棕色化相关表型，以UCP1及其他产热和线粒体生物合成相关标志物表达增加为特征。后续研究独立证实了CD肥厚性MAT中存在米色脂肪细胞，支持棕色化是该组织此前未被认识的特征。琥珀酸可促进肠系膜脂肪中白色向米色脂肪细胞转化，将微生物易位与CrF表型联系起来。犬尿喹啉酸介导的信号也参与了肠系膜脂肪组织棕色化，支持CrF内微生物、炎症和代谢信号的交互作用。因此，CrF棕色化可能成为CD的治疗靶点。然而，现有治疗是否影响该表型在很大程度上仍不清楚。抗肿瘤坏死因子（anti-TNF）药物包括英夫利西单抗广泛用于治疗CD。研究人员此前将抗TNF治疗与CrF炎症减轻、脂肪细胞大小恢复和免疫细胞浸润减少相关联。抗TNF治疗是否与CrF米色/棕色化表型相关尚不清楚，直接体外暴露人CrF于英夫利西单抗后是否出现相关分子改变亦不清楚。研究人员研究了抗TNF治疗是否与CrF中棕色化/产热、线粒体生物合成及免疫相关标志物相关，以及配对外植体直接体外英夫利西单抗暴露后是否出现相关改变。
研究人员开展了两个独立人类队列研究：观察性队列纳入19例未接受抗TNF和14例接受抗TNF治疗的CD患者（其中9例接受阿达木单抗，5例接受英夫利西单抗），分析CrF活检样本的代谢和炎症基因及蛋白表达，分离AdMSCs和成熟脂肪细胞，通过免疫组织化学和蛋白质印迹法评估UCP1蛋白丰度；体外队列纳入8例未接受抗TNF的CD手术患者，将配对CrF外植体在有或无英夫利西单抗（5 mg/kg等效剂量）条件下培养24 h，通过RT-qPCR和免疫组织化学分析。结论：抗TNF治疗与CD患者CrF中棕色化、线粒体生物合成及免疫相关分子重塑相关，配对体外实验支持直接英夫利西单抗暴露后出现棕色化/产热相关应答。这些发现将CrF确定为对anti-TNF暴露有应答的此前未被充分认识的组织区室，并提示该重塑涉及脂肪细胞祖细胞和成熟脂肪细胞。这些分子改变是否转化为功能性代谢重塑或有助于临床结局仍有待确立。重要意义在于揭示了肠系膜脂肪组织作为CD中对抗TNF治疗有应答的组织区室，为CrF棕色化作为治疗靶点提供了临床关联证据。
关键技术方法：研究人员采用观察性队列与体外实验相结合的设计。观察性队列纳入西班牙两家医院（Joan XXIII医院和Vall d'Hebron大学医院）因症状性并发症接受手术的CD患者，收集CrF活检样本。关键技术包括：胶原酶消化法分离CrF来源成熟脂肪细胞和基质血管组分（SVF），原代培养AdMSCs并进行免疫表型鉴定；免疫组织化学和蛋白质印迹法检测UCP1蛋白丰度；RT-qPCR检测棕色化、线粒体生物合成及免疫相关基因表达；对AdMSC条件培养基进行无标记液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学探索性再分析；配对CrF外植体体外英夫利西单抗暴露实验。
研究结果：（1）研究人群临床特征：观察性队列包括19例未接受抗TNF和14例接受抗TNF治疗的CD患者，两组人口学和临床特征总体可比。抗TNF治疗组血清IL-1β浓度显著较低（p<0.01），IL-6浓度组间无显著差异。体外队列包括8例未接受抗TNF的CD手术患者。（2）抗TNF治疗与CD患者CrF中棕色化、线粒体生物合成及免疫相关改变相关：免疫组织化学显示抗TNF治疗患者UCP1阳性面积显著高于未治疗患者，蛋白质印迹法证实UCP1蛋白丰度显著升高（n=4 vs. n=5）。全CrF基因表达分析显示抗TNF治疗患者TMEM26和CPT1B表达显著升高。抗TNF治疗患者CrF来源AdMSCs显示UCP1表达显著升高。条件培养基收集条件下AdMSCs未见基于BAX/BCL2比值的促凋亡信号增加证据。探索性条件培养基蛋白质组学分析识别出炎症信号、脂肪细胞代谢、氧化应激和细胞外基质/基质组织相关蛋白的差异。IL6在抗TNF治疗组丰度显著较低（log2倍数变化-5.35；名义p=0.000161；FDR校正p=0.092）。PRG4在名义显著性水平上丰度较高（log2倍数变化3.50；名义p=0.033；FDR校正p=0.993）。在573种蛋白的完整分析中，经Benjamini-Hochberg FDR校正后无蛋白保持显著。抗TNF治疗患者成熟脂肪细胞显示UCP1和PPARG表达显著升高，同时TFAM和NRF1表达升高。IL4、ADIPOQ和IL13组间无显著差异，而LEP和TNF表达显著降低，IL6保持不变。总体而言，这些发现将抗TNF治疗与CrF中棕色化、线粒体生物合成及免疫相关分子表型相关联，但未证明功能性产热或线粒体激活。（3）体外英夫利西单抗暴露调节CrF外植体中棕色化、线粒体生物合成及免疫相关标志物：配对CrF外植体来自未接受抗TNF患者，在有或无英夫利西单抗（5 mg/kg等效剂量）条件下培养24 h。UCP1免疫组织化学显示英夫利西单抗暴露后UCP1阳性面积较高。RT-qPCR显示英夫利西单抗暴露后UCP1（p=0.0023）、PPARG（p=0.0364）和CIDEA（p=0.0480）表达显著升高。线粒体生物合成相关标志物中，TFAM（p=0.0969）和NRF1（p=0.0646）呈上升趋势，NAMPT无显著差异。IL13表达显著升高（p=0.0435），IL4和ADIPOQ无变化。TNF和IL6呈非显著下降，LEP无显著差异。配对未处理与英夫利西单抗暴露外植体间BAX/BCL2比值无差异（n=4；p=0.875），平均18S rRNA Ct值可比（10.32±0.38 vs. 10.31±0.24；p=0.875）。初步剂量范围实验中，三名供体在5 mg/kg等效剂量下均显示UCP1、PPARG、ADIPOQ和NAMPT表达增加，在10或50 mg/kg等效剂量下无一致的进一步应答。探索性合并Pearson分析提示IL13与NAMPT之间（名义p=0.0424）及IL13与TFAM之间（名义p=0.0425）存在正相关。
讨论部分总结：研究人员此前描述了CrF中棕色化相关表型并将其与微生物易位和琥珀酸积累相关联。在此基础上，本研究将抗TNF治疗确定为与该表型相关的前所未认识的临床因素。治疗患者中UCP1丰度升高与成熟脂肪细胞相关改变及配对体外对英夫利西单抗的应答相汇聚，支持CrF作为对抗TNF暴露有应答的组织区室。CrF是CD中代谢和免疫活跃的组成部分，其细胞复杂性使脂肪细胞、基质细胞和免疫细胞之间能够交互作用。Zuo等独立在肥厚性MAT中识别出米色脂肪细胞并提出棕色化作为治疗轴。研究人员此前的工作将抗TNF治疗与CrF炎症减轻、脂肪细胞形态恢复和免疫细胞浸润减少相关联。本研究结果扩展了这些观察，提示抗TNF治疗在CrF中相关的效应可能不仅涵盖炎症重塑，还包括代谢重塑。鉴于TNF-α在脂肪细胞分化、代谢和线粒体功能中的既定作用，这一解释在生物学上是合理的。慢性TNF信号与脂肪组织中线粒体功能受损和产热程序抑制相关，提供了TNF抑制可能有利于棕色化相关表型的潜在框架。配对体外外植体中短期英夫利西单抗暴露后重叠的分子改变进一步支持英夫利西单抗在CrF内的局部效应，超越了与全身疾病控制相关的改变。CrF可影响回肠免疫应答并促进血管生成和纤维化过程。脂肪因子如脂联素也参与肠道免疫稳态并在实验性结肠炎中显示保护作用，支持进一步研究CD中脂肪细胞-免疫交互作用。此处观察到的促炎性较低的脂肪细胞谱与这种免疫代谢交互作用相容。IL13与线粒体生物合成相关标志物之间的探索性关联进一步提示协调的免疫-代谢改变，尽管这些观察需要在更大独立队列中验证。AdMSC条件培养基蛋白质组学分析提供了补充证据，表明抗TNF相关差异超越成熟脂肪细胞延伸至基质区室。IL6显示显著较低的丰度，PRG4在名义显著性水平上显示较高丰度；然而，两者经FDR校正后均未保持显著。因此，观察到的IL6、PPARD、PRG4、FMOD、LUM、COL12A1和氧化应激相关蛋白的差异应被视为探索性和假设生成性的。细胞外基质和基质蛋白改变可能与肠纤维化和血管生成相关。然而，条件培养基中检测到的蛋白不能假定为主动分泌，可能反映非经典释放、细胞外囊泡或低水平细胞渗漏。需要功能性条件培养基实验来确定这些差异是否对脂肪细胞表型发挥旁分泌效应。观察到的表型的细胞来源可能很复杂。CrF包含成熟脂肪细胞、脂肪来源基质细胞、巨噬细胞、内皮细胞及其他免疫和基质群体。研究结果提示抗TNF相关的CrF重塑跨越脂肪细胞谱系的不同阶段。来自抗TNF治疗患者的CrF来源AdMSCs代表脂肪细胞祖细胞，显示棕色化相关分子表型，而治疗患者的成熟脂肪细胞显示更广泛的米色样分子表型，以棕色化/产热和线粒体生物合成相关标志物改变为特征。短期英夫利西单抗暴露后全CrF外植体也出现棕色化相关改变，进一步提示该应答可在组织水平发生。尽管本研究无法解析体外应答的细胞贡献，但AdMSCs、成熟脂肪细胞和完整CrF之间的一致发现支持抗TNF相关重塑可能涉及脂肪细胞祖细胞和分化脂肪细胞的概念。应承认若干局限性：观察性队列相对较小且为横断面设计，尽管组间临床参数总体可比，但不能排除与疾病特征或治疗史相关的残余混杂。蛋白质组学分析涉及特别小的探索性亚组，靶向分子分析包括多重比较而无正式校正。棕色化和线粒体表型主要通过分子标志物而非功能测量评估，未进行米色脂肪细胞形态的专门组织形态学评估。体外研究缺乏同型对照和专门的功能性组织活力检测；BAX/BCL2表达和稳定的18S Ct值仅提供组织完整性可比的间接证据。短期外植体模型和有限的剂量范围实验也妨碍了关于时间或剂量依赖性效应的结论。最后，CrF异质性无法解析。需要更大队列和纳入线粒体呼吸、线粒体质量和补充代谢读数的功能学研究来验证和扩展这些发现。研究结论翻译：抗TNF治疗与CD患者CrF中棕色化、线粒体生物合成及免疫相关分子重塑相关，配对体外实验支持直接英夫利西单抗暴露后出现棕色化/产热相关应答。这些发现共同将CrF确定为对anti-TNF暴露有应答的此前未被充分认识的组织区室，并提示该重塑涉及脂肪细胞祖细胞和成熟脂肪细胞。这些分子改变是否转化为功能性代谢重塑或有助于临床结局仍有待确立。
