《Materials Today Bio》：Human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived small extracellular vesicles delivering CERS1 promote squamous differentiation in HPV16-positive cervical intraepithelial neoplasia via remodeling sphingomyelin metabolism
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宫颈癌在全球女性恶性肿瘤中位居第四，是导致女性癌症相关死亡的主要原因之一，构成重大公共卫生负担。高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）是宫颈癌的主要致病因素，其持续感染诱导宫颈鳞状上皮细胞发生累积性改变，导致宫颈上皮内瘤变（CIN），最终进展为浸润性宫颈癌。CIN
宫颈癌在全球女性恶性肿瘤中位居第四，是导致女性癌症相关死亡的主要原因之一，构成重大公共卫生负担。高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）是宫颈癌的主要致病因素，其持续感染诱导宫颈鳞状上皮细胞发生累积性改变，导致宫颈上皮内瘤变（CIN），最终进展为浸润性宫颈癌。CIN作为宫颈癌前病变，发病率约为宫颈癌的十倍，在20–34岁女性中发病率最高。病理学上CIN分为低级别和高级别病变，其中HPV16和HPV18是主要驱动亚型。因此，逆转HR-HPV阳性CIN的进展对于降低宫颈癌发病率至关重要。目前临床缺乏针对HR-HPV阳性CIN的无创有效治疗手段，即使采用环形电切术（LEEP）等标准手术治疗，约15%的高级别病变患者仍面临HPV残留或疾病进展风险，且现有物理治疗可对宫颈结构与功能产生不良影响，对育龄女性生殖健康构成潜在威胁。因此，深入阐明CIN发病机制并探索新型、有效、无创的治疗策略是当前CIN临床管理的迫切需求。HPV可调控感染宫颈鳞状上皮细胞的代谢以适应宿主环境，这种代谢重编程不仅为病毒复制提供必需生物材料，还影响宫颈鳞状上皮细胞的生物学行为。HPV感染引发的代谢失调主要涉及葡萄糖和脂质代谢。在葡萄糖代谢方面，HR-HPV E6蛋白使肿瘤抑制因子p53失活并激活缺氧诱导因子1α（HIF-1α），与E7蛋白协同上调M2型丙酮酸激酶表达，共同诱导Warburg效应，使细胞代谢从氧化磷酸化转向有氧糖酵解。在脂质代谢方面，HPV感染调控脂肪酸合成、β-氧化和脂筏组成等多个方面，通过激活固醇调节元件结合蛋白等转录因子促进内源性脂质合成，E6和E7癌蛋白还可诱导氧化应激导致脂质过氧化损伤。然而，能否利用工程化仿生平台靶向干预这些失调的代谢通路以逆转CIN进展尚不清楚。人脐带间充质干细胞（hucMSC）因其来源便利、增殖能力强和低免疫原性，已成为治疗移植物抗宿主病、自身免疫病乃至肿瘤的潜力候选者，但移植相关的潜在致瘤风险限制了其进一步临床应用。近年来研究人员逐渐认识到MSC的许多功能并非由细胞本身直接介导，而是通过其分泌的细胞外囊泡，特别是小细胞外囊泡（sEV，也称外泌体）实现。人脐带间充质干细胞来源小细胞外囊泡（hucMSC-sEV）直径约50–150 nm，继承hucMSC的核心功能特性而无致瘤性，作为无细胞生物工程治疗剂在治疗肿瘤和癌前病变方面展现出巨大潜力。然而，hucMSC-sEV能否通过重塑HR-HPV介导的宫颈病变异常代谢来逆转CIN恶性表型，以及能否利用人源相关的新方法学（NAMs）平台可靠评估此类疗效，仍属未知。本研究发现hucMSC-sEV显著促进S12细胞和HPV16阳性宫颈外口类器官（一种再现宫颈上皮关键特征的人源相关NAMs）的鳞状分化。多组学分析揭示hucMSC-sEV通过递送神经酰胺合成酶1（CERS1）促进C18神经酰胺（C18 Cer）合成，激活p53-TGM3信号轴，从而驱动鳞状分化程序。该机制发现在HPV16阳性S12细胞来源的NCG小鼠皮下异种移植瘤模型中得到进一步验证，hucMSC-sEV通过调控C18 Cer代谢有效抑制S12异种移植瘤生长并调节鳞状分化；反之，敲低hucMSC-sEV中的CERS1可显著消除其抑制S12异种移植瘤及调控分化的效应。综上，本研究阐明了hucMSC-sEV通过重塑鞘磷脂代谢促进宫颈鳞状上皮分化并抑制S12异种移植瘤生长的分子机制，建立了基于NAMs的CIN干预研究新范式，并提供了将工程创新与真实临床需求直接连接的临床可操作靶点和策略。
宫颈癌是全球女性第四大常见恶性肿瘤，也是女性癌症相关死亡的主要原因之一，构成重大公共卫生负担。高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）持续感染是宫颈癌的主要致病因素，其诱导宫颈鳞状上皮细胞发生累积性改变，导致宫颈上皮内瘤变（CIN），最终进展为浸润性宫颈癌。CIN作为宫颈癌前病变，发病率约为宫颈癌的十倍，在20–34岁女性中发病率最高，其中HPV16和HPV18是主要驱动亚型。目前临床缺乏针对HR-HPV阳性CIN的无创有效治疗手段，即使采用环形电切术（LEEP）等标准手术治疗，约15%的高级别病变患者仍面临HPV残留或疾病进展风险，且现有物理治疗可对宫颈结构与功能产生不良影响，对育龄女性生殖健康构成潜在威胁。因此，深入阐明CIN发病机制并探索新型、有效、无创的治疗策略是当前CIN临床管理的迫切需求。HPV感染可引发宫颈鳞状上皮代谢失调，主要涉及葡萄糖和脂质代谢，但能否通过靶向干预这些失调的代谢通路逆转CIN进展尚不清楚。人脐带间充质干细胞来源小细胞外囊泡（hucMSC-sEV）作为无细胞治疗剂展现出巨大潜力，但其能否通过重塑HR-HPV介导的异常代谢逆转CIN恶性表型仍属未知。基于此，研究人员开展了本研究，旨在探究hucMSC-sEV对HPV16阳性CIN鳞状分化的促进作用及其分子机制。研究人员发现hucMSC-sEV在S12细胞和HPV16阳性宫颈外口类器官中显著促进鳞状分化，多组学分析揭示其通过递送神经酰胺合成酶1（CERS1）促进C18神经酰胺（C18 Cer）合成，激活p53-TGM3信号轴驱动鳞状分化程序，并在NCG小鼠皮下异种移植瘤模型中得到验证。该研究发表于《Materials Today Bio》，阐明了hucMSC-sEV通过重塑鞘磷脂代谢促进宫颈鳞状上皮分化的分子机制，建立了基于新方法学（NAMs）的CIN干预研究新范式，为CIN治疗提供了临床可操作靶点和策略。在研究技术方法方面，研究人员采用超速离心法提取hucMSC-sEV并通过透射电镜和纳米颗粒跟踪分析进行鉴定；构建了患者来源宫颈外口类器官及稳定表达HPV16 E6/E7的HPV16阳性类器官模型（人源宫颈外口组织样本来自中山大学附属第七医院妇科因良性疾病行全子宫切除术的患者）；采用非靶向代谢组学、脂质组学和蛋白质组学等多组学分析；通过LC-MS/MS靶向检测C18 Cer；利用慢病毒体系实现CERS1过表达和敲低；并在NCG小鼠中建立S12细胞皮下异种移植瘤模型进行体内验证。研究结果如下：（1）HucMSC-sEV促进HPV16阳性CIN鳞状分化：在S12细胞中，30和60 μg/mL hucMSC-sEV显著促进鳞状分化标志物外皮蛋白（IVL）和角蛋白13（KRT13）的基因和蛋白表达，并扩大IVL阳性细胞群体；在HPV16阳性宫颈外口类器官中，hucMSC-sEV同样显著促进IVL和KRT13表达及IVL荧光强度，虽未恢复至正常类器官水平。研究表明从细胞系到类器官模型，hucMSC-sEV均能促进HPV16阳性CIN鳞状分化。（2）HucMSC-sEV上调C18 Cer促进HPV16阳性CIN鳞状分化：非靶向代谢组学和脂质组学分析显示hucMSC-sEV共培养组中C18 Cer（倍数变化=11.55）及其前体C18二氢神经酰胺（倍数变化=9.35）显著上调；靶向检测显示C18 Cer含量随hucMSC-sEV浓度呈剂量依赖性增加，30 μg/mL组较对照增加超过98.7倍；外源性C18 Cer处理显著促进S12细胞和HPV16阳性类器官中IVL和KRT13表达及IVL阳性细胞比例。研究表明hucMSC-sEV通过调控鞘磷脂代谢上调C18 Cer合成促进CIN鳞状分化。（3）HucMSC-sEV通过上调C18 Cer激活p53-TGM3通路促进HPV16阳性CIN鳞状分化：蛋白质组学分析显示C18 Cer处理组与正常类器官共同上调p53信号通路和表皮细胞分化、角化信号通路；TP53敲低或p53抑制剂PFTα处理显著抑制C18 Cer诱导的IVL、KRT13、p53和TGM3蛋白表达；神经酰胺合成酶抑制剂FB1显著抑制hucMSC-sEV诱导的上述蛋白表达。研究表明hucMSC-sEV通过C18 Cer激活p53-TGM3通路促进鳞状分化。（4）HucMSC-sEV通过C18 Cer在体内抑制S12异种移植瘤生长并促进鳞状分化：在NCG小鼠皮下S12异种移植瘤模型中，hucMSC-sEV和C18 Cer均显著抑制肿瘤生长，降低肿瘤体积和重量，升高IVL、p53和TGM3水平，而FB1可逆转上述效应。研究表明hucMSC-sEV通过C18 Cer在体内激活p53和TGM3表达，促进鳞状分化并有效抑制S12异种移植瘤生长。（5）HucMSC-sEV向S12细胞和HPV16阳性类器官递送CERS1：Western blot证实hucMSC和hucMSC-sEV均含CERS1而无sEV条件培养基不含；hucMSC-sEV不影响CERS1基因表达但显著增加细胞内CERS1蛋白表达；免疫荧光显示CD63与CERS1共定位分布，CERS1荧光强度随sEV浓度呈剂量依赖性增加。研究表明hucMSC-sEV可向靶细胞递送CERS1。（6）CERS1过表达上调C18 Cer激活p53-TGM3通路促进鳞状分化：在S12细胞和HPV16阳性类器官中过表达CERS1可增加C18 Cer合成，升高p53和TGM3蛋白表达，促进IVL和KRT13表达及IVL荧光强度。研究表明CERS1过表达通过上调C18 Cer激活p53-TGM3通路促进鳞状分化。（7）敲低CERS1的hucMSC-sEV下调C18 Cer、失活p53-TGM3通路并抑制CIN鳞状分化：制备CERS1敲低sEV（sEV shCERS1），其CERS1表达显著降低；sEV shCERS1处理的S12细胞C18 Cer水平回落至接近对照水平；sEV shCtrl诱导的p53、TGM3、IVL和KRT13表达上调被CERS1敲低所逆转。研究表明CERS1是hucMSC-sEV上调C18 Cer促进鳞状分化的关键介导因子。（8）体内敲低CERS1的hucMSC-sEV失活p53-TGM3通路并抑制鳞状分化：在NCG小鼠S12异种移植瘤模型中，sEV shCtrl显著抑制肿瘤生长而sEV shCERS1无此效应；sEV shCtrl组肿瘤中CD63与CERS1共定位，sEV shCERS1组仅见CD63信号；sEV shCtrl显著升高IVL、p53和TGM3蛋白水平，而CERS1敲低显著降低这些蛋白表达。体内实验进一步证实hucMSC-sEV通过递送CERS1发挥促分化和抑制S12异种移植瘤生长效应。讨论部分总结：研究人员围绕hucMSC-sEV通过重塑鞘磷脂代谢促进鳞状分化和抑制S12异种移植瘤生长进行了系统讨论。HR-HPV E6/E7癌蛋白持续表达破坏宿主细胞增殖与分化平衡是CIN发生的核心机制，E6蛋白介导p53降解使细胞逃避凋亡，E7蛋白降解视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）驱动异常细胞周期进展，二者协同作用阻断上皮细胞正常分化，形成"增殖与分化脱偶联"的恶性表型。MSC-sEV通过复杂的生物活性物质货物在多个系统中展现调控细胞分化的强大能力，本研究通过非靶向代谢组学结合脂质组学发现hucMSC-sEV显著上调S12细胞C18 Cer合成，C18 Cer在S12细胞和HPV16阳性类器官中诱导显著的促鳞状分化表型，并在NCG小鼠S12异种移植瘤模型中得到验证，提示hucMSC-sEV可能通过调控鞘脂代谢逆转恶性表型。C18 Cer是hucMSC-sEV促进CIN鳞状分化的核心信号介质，CERS1是调控C18 Cer合成的关键细胞内分子，敲低hucMSC-sEV中CERS1显著降低其体外促分化活性和体内干预疗效，体内外实验共同验证外泌体CERS1是hucMSC-sEV促进正常鳞状分化的关键因子。基于研究发现，hucMSC-sEV通过递送CERS1调控C18 Cer代谢并激活非经典p53信号促进宫颈鳞状分化，提供了临床前依据，尽管临床前景尚待确立。与传统物理切除或抗病毒治疗相比，hucMSC-sEV提供了一种旨在促进CIN鳞状分化的"代谢重塑"策略，可能适用于不愿接受侵入性治疗的持续HR-HPV感染患者。未来转化路径可聚焦于开发宫颈靶向局部递送系统以延长sEV在转化区的滞留时间、通过工程化优化sEV功能（如过表达CERS1增强促分化疗效）、利用组织C18 Cer水平和p53-TGM3通路激活状态作为治疗反应的预测生物标志物以实现精准患者分层。尽管在大规模生产、标准化质量控制和给药方案优化方面仍存在产业化挑战，hucMSC-sEV作为有前景的临床前治疗候选者，有望为宫颈癌前病变提供新型代谢干预策略。研究结论翻译：综上，本研究揭示了一条新的CERS1-C18 Cer-p53-TGM3信号级联，hucMSC-sEV通过该级联重塑鞘磷脂代谢、促进鳞状分化并抑制皮下S12异种移植瘤模型中的肿瘤发展。通过递送CERS1上调C18 Cer合成并激活非经典p53信号，hucMSC-sEV驱动鳞状分化程序并在CIN中发挥抗肿瘤效应。研究结果揭示了sEV来源CERS1在调控鞘磷脂代谢和鳞状分化中的关键作用，为CIN提供了新的治疗策略。在体外S12细胞系、HPV16阳性宫颈外口类器官模型和体内NCG小鼠皮下异种移植瘤模型中的双重验证凸显了结果的稳健性，将hucMSC-sEV定位为CIN及HPV驱动宫颈病变的有前景的无细胞治疗手段。
