《Materials Today Bio》：Scaffold-free self-assembled cell ring organoids enable efficient tumor modeling with high engraftment rates, superior tumor uniformity, and reduced animal consumption
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背景：传统肿瘤细胞悬液异种移植存在移植效率低、潜伏期长、肿瘤均一性差等问题，且动物消耗量大，与3R原则（替代、减少、优化）相冲突。本研究旨在开发无支架自组装细胞环类器官平台以解决上述瓶颈。方法：将肿瘤细胞与成纤维细胞按优化比例混合并接种于微孔模具中，在24–4
背景：传统肿瘤细胞悬液异种移植存在移植效率低、潜伏期长、肿瘤均一性差等问题，且动物消耗量大，与3R原则（替代、减少、优化）相冲突。本研究旨在开发无支架自组装细胞环类器官平台以解决上述瓶颈。方法：将肿瘤细胞与成纤维细胞按优化比例混合并接种于微孔模具中，在24–48 h内无需外源性基质或水凝胶即可自发自组装为环状类器官。体外表征包括活/死染色、组织学、免疫荧光、流式细胞术、Western blotting及转录组测序。体内性能通过原位移植至免疫缺陷或免疫健全小鼠股骨外侧髁进行评估，并采用生物发光成像和微型CT进行纵向监测。结果：细胞环在体外培养期间保持高活力，且兼容细胞系与临床原代肉瘤细胞。免疫荧光和Western blotting显示，共培养的成纤维细胞在细胞环类器官内发生癌相关成纤维细胞（CAF）样表型转化（α-SMA上调）。转录组分析进一步表明，细胞环类器官的基因表达谱与原始肿瘤高度相似，而2D培养细胞显示出数量和幅度最大的差异表达基因。体内实验中，与细胞悬液相比，细胞环类器官实现了更高的移植率、更好的肿瘤均一性和更强的骨侵袭能力。结论：无支架自组装细胞环类器官平台为动物肿瘤建模提供了一种高效、均一且符合3R原则的策略。该技术无需外源性基质，与传统方法相比显著提高了移植率和肿瘤均一性，有效减少了动物消耗，并可能为未来临床前药物筛选和肿瘤微环境（TME）研究提供潜在平台。
**研究背景与问题**
骨肉瘤临床前研究高度依赖动物肿瘤模型来评估抗肿瘤药物的体内疗效与生物安全性，是基础机制研究与临床转化之间的核心桥梁。为重现骨肉瘤原发肿瘤生长、骨侵袭和肺转移等关键疾病特征，研究人员已建立多种小鼠建模方法，主要包括细胞悬液注射模型、基因工程小鼠模型（GEMMs）和患者来源异种移植（PDX）模型三大类。然而，上述主流模型均存在不可避免的局限性：细胞悬液原位胫骨内注射常导致肿瘤细胞栓塞；颌周原位模型虽肿瘤生长较均匀，但伦理规范限制颌部肿瘤最大体积；尾静脉注射建模操作复杂且肺定植效率不稳定；免疫缺陷宿主无法研究完整的肿瘤免疫微环境；GEMMs依赖定制转基因品系构建，实验门槛高；PDX模型建立周期长，难以满足药物筛选的通量需求。上述模型均无法同时实现高移植率、均匀肿瘤生长和减少动物消耗，移植成功率不一致且组内肿瘤生长变异性大，有效实验往往需要大量小鼠，这与当前动物研究倡导的"替代、减少、优化"（3R）伦理原则相冲突，严重制约了骨肉瘤侵袭、转移及靶向治疗的标准化体内研究。近年来3D类器官培养技术快速发展，但现有主流3D肿瘤建模方法——外源性基质（如Matrigel或胶原）支持的类器官培养体系和直接注射解离单细胞悬液的异种移植方案——均存在显著局限：基质成分复杂、批间稳定性差、机械参数难以标准化，严重影响实验可重复性，且残留基质可能引发局部炎症反应干扰TME评估；单细胞悬液移植破坏了天然的细胞-细胞及细胞-基质相互作用，使移植细胞易发生失巢凋亡和流体介导的清除，最终导致移植率低、潜伏期多变和明显的组内肿瘤异质性。因此，开发一种无需外源性基质且能保持完整细胞相互作用结构的新型类器官移植平台，是骨科肿瘤动物模型领域亟待解决的未满足需求。
**技术方法概述**
研究人员采用琼脂糖（AG）和聚苯乙烯（PS）微孔模具引导肿瘤细胞（143B/K7M2）与成纤维细胞（HSF/MEF）在24–48 h内自发自组装为环状类器官，无需外源性基质或水凝胶。体外表征采用活/死染色、组织学（H&E、Masson三色、Van Gieson、ALP染色）、免疫荧光、扫描电镜（SEM）、流式细胞术、Western blotting及bulk RNA测序。体内采用股骨外侧髁原位移植至裸鼠或BALB/c小鼠，通过生物发光成像（BLI）和微型CT（micro-CT）纵向监测。临床原代软组织肉瘤（STS）细胞来源于湖南省肿瘤医院4例手术切除标本（病例S0812、S0113、S0114、S1105），经伦理委员会批准（KY2022233）。动物实验经浙江大学实验动物福利与伦理审查委员会批准（ZJU20260796）。
**研究结果**
**3.1 无支架细胞环类器官的制备与多细胞来源验证**
研究人员设计了基于琼脂糖和聚苯乙烯微孔模具的两种无支架自组装方案，肿瘤细胞与成纤维细胞混合接种后24–48 h内自发组织为形态良好的环状结构，可被手术镊直接夹取移植。成纤维细胞与肿瘤细胞比例是关键参数，增加成纤维细胞比例可显著增强环的机械稳定性，归因于成纤维细胞分泌的内源性ECM蛋白（如I型胶原和纤连蛋白）作为天然生物支架。总细胞数为0.5×10?时环呈半透明且结构松散，增至0.6–0.8×10?时紧凑度和不透明度明显改善。小鼠MEF/K7M2体系成功成环，4例临床原代STS样本与HSF按1:1比例（每环0.6×10?细胞）共培养均在48 h内形成结构完整的细胞环，证实该自组装策略具有跨物种适应性。琼脂糖因固有抗黏附特性产生表面更光滑、轮廓更均匀的环；聚苯乙烯模具需抗黏附涂层预处理方能实现自组装。机制上，成纤维细胞分泌胶原等ECM建立物理细胞间连接驱动细胞聚集，肿瘤细胞单独产生内源性ECM不足，需引入成纤维细胞提供无支架自组装所需的基质支架。
**3.2 体外活力、结构表征与共培养成纤维细胞的CAF样转化**
活/死染色显示第1、3、5天活细胞比例均超过70%，后期活力下降主要因细胞增殖导致内芯区域细胞死亡，符合无血管3D培养中营养扩散受限的现象，而环外表面区域始终保持密集活细胞群。荧光示踪（143B-RFP+HSF-GFP）清晰显示肿瘤细胞与成纤维细胞散布于整个环结构，成纤维细胞形成互联网络包裹肿瘤细胞簇，形态上类似人肿瘤组织中的CAF组织方式。H&E染色比较环状与实心球形3D构建体：两者均含成纤维细胞沉积的胶原基质，但实心球因营养转运受损出现广泛中央坏死区，而环状结构受益于中央管腔增强物质交换，无显著中央坏死且结构完整性更优。Masson三色和Van Gieson染色显示广泛分布的胶原纤维网络，证明共培养成纤维细胞在自组装阶段主动分泌丰富ECM构建内源性支持支架。原代肉瘤来源细胞环的ALP染色显示局灶阳性信号，证实骨肉瘤细胞成骨分化潜能得以保留。Western blotting和α-SMA免疫荧光比较三组样本：2D培养HSF几乎检测不到α-SMA蛋白表达；单纯成纤维细胞3D环显示可检测但低水平的α-SMA表达，表明3D机械应力 alone 可诱导轻度成纤维细胞活化；HSF+143B共培养3D环则 exhibit 显著上调的α-SMA蛋白水平和广泛高强度的α-SMA丝状信号。这表明细胞环系统在体外培养阶段即完成基质细胞预激活，在移植前建立促肿瘤基质微环境，是细胞环移植效率优于传统单细胞悬液的关键机制。
**3.3 转录组验证细胞环类器官对原始肿瘤的分子保真性**
对2D培养细胞、细胞系来源细胞环类器官、原代细胞环类器官和患者肿瘤标本进行bulk RNA测序。PCA显示传统2D培养细胞与临床肿瘤样本聚类距离较远，而细胞系来源和原代细胞环类器官均落在天然肿瘤组织分布范围内，表明3D自组装环结构重塑了全局基因表达谱。Venn图显示原代细胞环类器官总DEG数最低、特异性转录扰动最少，与天然肿瘤基因表达模式一致性最高。火山图显示细胞系单独与肿瘤组织的比较产生大量显著上/下调基因，表明细胞环类器官能保留绝大多数天然肿瘤转录特征，而长期2D培养导致大规模转录漂移。GO功能富集分析鉴定出突触重塑、ECM组装、离子通道转运、胶质细胞突起形成和受体-配体信号调控等排名靠前条目，反映3D多细胞结构与分散单层细胞的核心表型差异。KEGG通路富集分析鉴定出线粒体自噬和通用自噬通路显著富集（归因于3D环结构内营养和氧梯度激活适应性自噬反应）、钙信号、MAPK信号、多种神经元突触通路和细胞因子-受体相互作用通路显著富集。转录组结果证实该平台能恢复天然肿瘤核心转录程序，具有比传统单层细胞悬液更强的TME重现能力。
**3.4 体内移植：细胞环类器官移植效率和肿瘤均一性显著优于细胞悬液**
比较传统细胞悬液注射与手术移植细胞环类器官两种体内建模方式。BLI纵向评估显示移植后第14天细胞环组信号集中于植入部位，而悬液组信号弥散分布，表明细胞环类器官能防止流体介导的自由细胞丢失和播散。肿瘤生长曲线显示细胞环组肿瘤早在移植后第5–7天即可观察，而悬液组一般潜伏期延长至10–14天；后续所有检测时间点细胞环组肿瘤体积均显著大于悬液组。多次独立重复实验证实细胞环组移植率和组内肿瘤生长同步性优于传统悬液建模，终点肿瘤重量和体积统计结论完全一致。组内变异系数（CV）分析表明细胞环组个体动物间肿瘤体积波动显著小于悬液组，表明该方法构建的动物模型具有更强的肿瘤均一性，可减少每次实验所需动物数量，符合3R原则。K7M2/MEF细胞环在免疫健全小鼠股骨外侧髁移植验证同样显示高移植率和快速生长特征，进一步支持平台跨物种适用性，并表明免疫健全正常小鼠可用于该细胞环类器官肿瘤建模。
**3.5 细胞环类器官展现增强的骨侵袭能力与密切重现临床骨肉瘤的病理特征**
BLI信号在细胞环组随时间持续显著增加，micro-CT三维重建显示环来源肿瘤呈现特征性溶骨性生长模式，肿瘤侵袭股骨皮质并延伸至髓腔，伴局灶性骨小梁丢失和骨膜反应，且骨侵袭能力随肿瘤体积增大而进一步加剧。H&E染色证实环来源肿瘤组织含丰富类骨质基质沉积、肿瘤成骨和活跃破骨细胞——与临床骨肉瘤患者活检病理高度一致的病理特征，而悬液来源肿瘤骨破坏和肿瘤骨基质形成明显较弱。Masson三色染色显示环来源肿瘤内广泛蓝色胶原纤维沉积，SEM进一步证实其致密纤维状ECM网络结构。这些病理特征密切镜像临床骨肉瘤活检病理。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是骨肉瘤微环境重要组分，在肿瘤进展、骨破坏和耐药中发挥关键作用。研究人员将RAW264.7小鼠巨噬细胞与K7M2骨肉瘤细胞和MEF成纤维细胞共接种于琼脂糖微孔模具进行三培养自组装探索性研究，流式细胞术显示培养第2天类器官内F4/80阳性巨噬细胞比例达11.7%，免疫荧光可视化广泛巨噬细胞浸润至细胞环基质；第4天巨噬细胞比例降至3.5%，反映长时间体外培养中巨噬细胞因基质屏障和趋化因子梯度变化等因素逐渐丢失。初步结果表明该平台具有整合免疫细胞构建更完整肿瘤免疫微环境的潜力。
**讨论与结论**
本研究构建并系统表征了无支架自组装细胞环类器官肿瘤建模平台，利用肿瘤细胞-成纤维细胞共培养体系的内在自组织特性自发形成富含内源性ECM、结构稳定且可直接手术植入的3D类器官结构，不依赖外源性基质凝胶或水凝胶。与传统单细胞悬液移植相比，细胞环类器官系统实现更高移植率、更快肿瘤生长动力学和更优组内肿瘤均一性，有效减少实验动物使用并降低实验偏倚，与3R原则核心要求高度一致。当前主流类器官培养系统普遍依赖Matrigel或胶原等外源性基质，其成分复杂、批间变异显著且残留生长因子易干扰药敏检测结果；本研究采用共培养成纤维细胞分泌的内源性ECM替代传统外源性支架。与常规球体相比，典型球体直径限于100–200 μm，实心球体超过约500 μm时营养和氧有限扩散不可避免导致广泛中央坏死，而本构建体的中空环架构使所有区域保持在临界扩散限度内。细胞环优异体内成瘤性能源于多机制协同调控：细胞环在体外已具备成熟细胞-细胞和细胞-ECM连接，移植后无需单细胞再聚集过程，显著缩短肿瘤细胞暴露于失巢凋亡风险的时间窗口；共培养成纤维细胞在3D自组装过程中预激活为CAF样表型，表达高水平α-SMA并持续提供旁分泌信号，在移植前构建预激活促肿瘤基质微环境；完整致密环状物理结构将细胞锚定于植入部位，显著减少移植后细胞播散和流体介导的冲洗丢失。转录组分析为平台高保真重现天然肿瘤表型提供分子层面系统确认，原代肉瘤来源细胞环与临床肿瘤组织基因表达谱相似性最高。股骨原位移植模型验证了细胞环类器官在骨肉瘤特异性病理模拟中的独特价值，环来源肿瘤准确重现皮质骨侵袭、髓腔浸润、骨小梁破坏和肿瘤类骨质基质沉积等临床骨肉瘤特征性病理特征。免疫共培养实验证实RAW264.7巨噬细胞可稳定整合入3D细胞环结构，证明该无支架自组装系统具备容纳免疫细胞构建多细胞复合肿瘤模型的能力。K7M2/MEF小鼠细胞环的成功构建和体内成瘤证实技术具有良好跨物种适用性。研究同时指出若干局限：转录组分析临床和细胞样本数量有限；技术验证主要集中于骨肉瘤和STS；仅表征转录组水平缺乏蛋白质组和代谢组等多组学交叉验证；RAW264.7三培养体系尚处体外探索阶段；未探索体内移植瘤血管化；HSF作为基质组分非组织匹配基质细胞，CAF身份确定需FAP、PDGFRα和podoplanin等多标志物联合分析。
结论部分翻译：本研究报道了一种基于无支架自组装细胞环类器官的新型动物肿瘤建模平台。该技术无需外源性基质或水凝胶，通过肿瘤细胞与成纤维细胞共培养自组装产生具有内源性ECM支持的环状类器官，在体内实现持续高移植率。肿瘤生长动力学、均一性和TME保真度均显著优于传统细胞悬液方法。Western blotting和免疫荧光证实共培养成纤维细胞在类器官内发生CAF样表型转化（α-SMA上调），转录组分析为平台保留原始肿瘤基因表达特征的能力提供分子层面验证。股骨外侧髁原位移植模型证明环来源肿瘤具有更强的骨侵袭能力和临床骨肉瘤病理特征；流式细胞术和免疫荧光验证RAW264.7巨噬细胞成功整合入细胞环类器官。该方法适用于不同物种的组织细胞，有效减少动物消耗符合3R原则，并可能为临床前药物筛选、肿瘤-基质相互作用研究和个性化肿瘤模型建立提供潜在平台。
