《Mechanisms of Ageing and Development》：Resveratrol protects primary hepatocytes against senescence induced by endogenous toxic metabolites
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肝功能障碍患者血浆中内源性毒性代谢物（如胆红素和氨）的蓄积是肝功能不全的普遍特征。将原代肝细胞暴露于肝病血浆中循环的毒性代谢物可触发一种新型细胞衰老状态（SILT）。SILT损害肝细胞关键功能，包括白蛋白和尿素合成。SILT表型在转录组水平上区别于其他衰老状态
肝功能障碍患者血浆中内源性毒性代谢物（如胆红素和氨）的蓄积是肝功能不全的普遍特征。将原代肝细胞暴露于肝病血浆中循环的毒性代谢物可触发一种新型细胞衰老状态（SILT）。SILT损害肝细胞关键功能，包括白蛋白和尿素合成。SILT表型在转录组水平上区别于其他衰老状态，包括类衰老相关分泌表型（SASP）以及促凝血/抗凝血平衡失调。通过基因集富集分析（GSEA）可在人类病变肝脏样本中检测到SILT。白藜芦醇可预防SILT。
研究背景方面，肝脏是受衰老影响的关键器官，承担血浆蛋白合成、外源性物质代谢及氨转化为尿素等功能。肝功能障碍发生率随年龄显著增加，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD，现称代谢相关脂肪性肝病MASLD）、酒精相关性肝病及自身免疫性肝病的频率和严重程度在65岁以上人群中均升高。内源性毒性代谢物如胆红素和氨在患者血浆中的蓄积是肝功能不全的一般特征，这些毒素对 other 器官产生危及生命的影响（如肝性脑病），导致肝衰竭相关的高死亡率和发病率。肝移植是肝衰竭的首选治疗方法，但供体器官严重短缺，约半数转诊患者不符合严格适配标准，符合条件者中20%在获得合适器官前死亡，中位等待时间为135天。生物人工肝系统（BALS）是替代供体器官缺乏的有吸引力的方案，依赖200–500 g肝细胞（通常为HepG2亚克隆）提供必要的生物转化和合成功能，但迄今测试的所有此类装置均失败，部分原因可能是与肝衰竭动物血清中的毒素接触破坏了肝细胞执行核心肝功能的能力，尽管细胞仍保持活力。研究人员此前发现，将HepG2细胞暴露于生理相关浓度的内源性毒素6小时（BALS治疗的平均持续时间）可快速诱导衰老样状态，表现为p53、p21和p16激活、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-GAL）活性增加及SASP特征性促炎细胞因子分泌，研究人员将此现象命名为肝毒素诱导的衰老（SILT），伴随氨解毒和白蛋白合成显著丧失，且5 μM白藜芦醇可预防SILT。鉴于毒素在体内因肝功能不全而普遍存在，以及基于原代猪肝细胞的新一代BALS装置的设计，确定SILT是否为仅限于肝细胞系的現象还是具有更普遍意义十分重要。因此，本文报告标准化肝源性毒性代谢物对人 and 猪供体原代肝细胞在二维和三维培养条件下再生能力和功能状态的影响，在转录组水平表征SILT表型，并在健康和病变人肝脏参考数据集中测量其特征性转录组特征。
研究人员开展的研究包括：使用标准化的内源性毒素混合物（含肌酐、胆红素、鹅去氧胆酸钠、氨、尿素及细胞因子IL-6、IL-8、TNFα）处理原代人肝细胞（PHH）和原代猪肝细胞（PPH），培养于二维胶原包被板和三维HEMA-MBA-藻酸盐冷冻凝胶支架中，评估细胞活力、增殖、衰老标志物表达、白蛋白和尿素合成功能，并进行转录组测序和基因集富集分析（GSEA）。结论表明，SILT同样发生于PHH和PPH，且可被白藜芦醇预防；SILT损害肝细胞关键功能；毒素暴露诱导HepG2和PHH中衰老相关转录程序；SILT抑制肝细胞功能和代谢基因表达；SILT相关转录程序与公共慢性肝病微阵列数据集存在显著关联。这些发现的重要意义在于揭示了SILT是存在于原代肝细胞中的普遍现象，为改进BALS设计及理解肝病中衰老相关功能障碍提供了新视角，并提示白藜芦醇可能作为干预手段。
主要关键技术方法包括：原代肝细胞二维和三维HEMA-MBA-藻酸盐冷冻凝胶培养（PHH购自Thermo Fisher Scientific，PPH购自PRIMACYT Cell Culture Technology GmbH，来源于5月龄雌性G?ttingen小型猪）；肝毒素混合物处理（6小时）；MTS法和活/死细胞染色评估活力；EdU掺入和Ki67标记检测增殖；实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测p53、p21、p16等基因表达；SA-β-Gal活性检测；酶联免疫吸附试验（ELISA）测定白蛋白；尿素测定试剂盒检测尿素；转录组测序（RNA-seq，Illumina NovaSeq X Plus平台）；GSEA分析公共慢性肝病数据集（GSE14323丙型肝炎相关肝硬化、GSE33814非酒精性脂肪性肝炎、GSE28619酒精相关性肝炎）。
研究结果方面：（1）SILT发生于PHH和PPH并可被白藜芦醇预防——通过MTS和活/死染色显示毒素对PHH和PPH总体活力无显著影响；EdU和Ki67标记显示毒素显著降低PPH和PHH的增殖分数，白藜芦醇共处理可完全或部分预防此下降；qPCR显示毒素处理上调PHH中p53、p21和p16表达，白藜芦醇显著降低p21和p16 mRNA水平，PPH中p53和p21显著上调，白藜芦醇仅显著降低p21；SA-β-Gal染色显示毒素处理后PHH和PPH中SA-β-Gal阳性细胞百分比显著增加，白藜芦醇共处理显著降低。（2）SILT损害PHH和PPH关键肝功能且白藜芦醇具有保护作用——通过ELISA检测显示PHH和PPH在二维和三维培养中白蛋白产生显著降低，白藜芦醇处理可显著提高白蛋白水平。（3）PHH和PPH在二维和三维培养系统中的尿素合成——尿素测定显示毒素暴露后PHH和PPH尿素合成显著受损，三维培养中白藜芦醇共处理可显著提高尿素合成，显示部分保护作用；白藜芦醇单独处理可显著增强尿素产生。（4）毒素暴露诱导HepG2和PHH中衰老相关转录程序——通过RNA-seq和功能富集分析显示HepG2细胞毒素暴露后5883个基因显著上调和4836个基因下调，富集于细胞周期检查点调控、p53介导信号、DNA损伤反应和黏着斑；PHH中2245个基因上调和1488个基因下调，富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、ECM-受体相互作用、黏着斑、MAPK、PI3K-Akt和JAK-STAT信号通路；与氧化应激诱导衰老HepG2数据集比较显示部分基因重叠。（5）SILT抑制肝细胞功能和代谢基因表达——通过热图分析显示毒素暴露下调HepG2和PHH中解毒酶（GSTA1/2、UGT家族）、胆汁酸代谢调节因子（CYP7A1、CYP8B1）、凝血/合成蛋白（FGB、FGG、KNG1、SERPINA6）及CPS1等基因表达，HNF4A下调。（6）SILT相关转录程序与公共慢性肝病微阵列数据集的比较——通过GSEA显示SILT上调基因在HCV相关肝硬化（p.adj = 3.05 × 10?33）和NASH（p.adj = 1.55 × 10?2?）数据集中显著正富集，在酒精相关性肝炎中无显著富集（p.adj = 0.83）；SILT下调基因在HCV相关肝硬化和NASH中显示显著负富集。
讨论部分总结：研究人员此前已确立短期暴露于内源性肝毒素混合物可触发HepG2细胞衰老状态，并提出SILT是BALS失败的主要原因之一。本研究表明原代人 and 猪肝细胞同样发生SILT，表现为不可逆的增殖能力丧失、细胞周期依赖性激酶抑制剂（尤其是p21）水平快速升高、SA-β-Gal反应性高及SASP特征性促炎细胞因子分泌增加，伴随白蛋白产生、氨转化为尿素及外源性物质代谢相关酶表达的显著丧失。由于猪肝细胞已被多个团队提议作为BALS中HepG2的替代品，这表明SILT是生物工程师改进下一代装置时必须考虑的普遍现象。白藜芦醇预处理和共处理可减轻肝毒素诱导的衰老，且白藜芦醇耐受性良好。转录组分析揭示SILT的分子基础，包括KLF4诱导支持通过p21/p53调控的生长停滞，AP-1（FOS/JUN）作为SASP基因表达的转录调节因子，S100A2和ANXA10反映肝细胞应激适应和生长控制；SASP样分泌表型包括MMP1、MMP3、MMP10、TIMP1及IL-8、IL-6、IL-11、IL-4RA等细胞因子上调；同时肝细胞代谢、解毒和合成基因表达受抑制，包括胆汁酸代谢、解毒和血浆蛋白合成相关基因，以及纤维蛋白原亚基（FGB、FGG）和高分子量激肽原（KNG1）下调，提示SILT可能驱动肝病中促凝血/抗凝血失衡。GSEA分析表明SILT特异性转录特征在HCV相关肝硬化和NASH公共数据集中显著富集，而在酒精相关性肝炎中无富集或呈反向富集，表明毒素暴露触发的分子程序与人类慢性炎症性和纤维化肝损伤驱动程序高度相似。研究结论翻译：总之，这些结果与以下模型一致：毒素暴露驱动肝细胞进入衰老样状态，其特征不仅是应激和SASP基因的诱导，还包括对肝功能至关重要的代谢和合成程序的抑制。这种双重表型转变反映了在衰老和肝病体内报道的变化，其中衰老肝细胞的积累导致代谢衰退和促炎性组织重塑，并可能是肝病进展过程中器官功能加速衰竭的原因。通过体内补充白藜芦醇可在多大程度上改善此状况仍是一个开放性问题。
