促进血管生成的干细胞来源血管细胞外基质修饰透明质酸水凝胶的研发

《Journal of Anatomy》：Development of a pro-angiogenic stem cell-derived vascular cell extracellular matrix-decorated hyaluronic acid hydrogel

　　

摘要专业翻译 糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcers, DFU）是一种使人衰弱的慢性创面，影响多达三分之一的糖尿病患者。由于潜在的糖尿病病理生理改变，正常的创面愈合过程受到干扰。特别是创面床的再血管化不足，最终导致慢性创面的形成。目前的治疗方案不足以刺激再血管化和创面闭合，最终导致约20%的DFU患者需要下肢截肢。细胞外基质（extracellular matrix, ECM）来源的生物材料已被证明在促进组织血管化和创面修复方面具有巨大潜力。本研究的总目标是开发一种来源于人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cell, hiPSC）衍生血管细胞的脱细胞ECM，并将其整合到基于透明质酸的水凝胶中用于创面愈合。hiPSC的血管分化产生了包含表达CD31的内皮细胞（iEC）和CD31阴性基质细胞（iSC）的异质性细胞群体。通过抗坏血酸和大分子拥挤剂卡拉胶处理刺激iSC的ECM沉积。脱细胞处理后，通过免疫荧光和组织学染色分析ECM组成，结果表明ECM中存在纤连蛋白、纤维状胶原蛋白、串珠素（perlecan）和糖胺聚糖（glycosaminoglycans, GAGs）等成分，这些成分均与血管生成过程相关。在二维培养中，将脱细胞ECM添加到细胞培养基中可加速iEC形成管状结构的能力。用这种脱细胞ECM修饰基于透明质酸（hyaluronic acid, HyA）的水凝胶，可增强接种在这些水凝胶上的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人真皮成纤维细胞的代谢活性和附着能力。综上所述，这种ECM修饰的HyA基水凝胶具有在DFU等慢性创面应用中增强血管生成和再血管化的潜力。

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一、研究背景与意义

慢性创面，尤其是糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcers, DFU），是糖尿病的一种严重且危及生命的并发症，影响19%至34%的糖尿病患者。正常的创面愈合通常经历止血、炎症、增殖和重塑四个重叠阶段，但糖尿病病理生理改变——包括高血糖诱导的血管收缩性降低、血流量减少和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）分泌减少——导致创面再血管化不足，从而阻碍组织修复。愈合延迟增加了创面暴露于环境的时间，使患者易受感染和骨髓炎的影响。目前的DFU治疗手段包括清创、创面敷料、压力卸载和抗生素治疗等，但这些标准治疗方案在临床上仍不充分，最终导致约20%的DFU患者需要下肢截肢。因此，亟需开发能够促进血管生成和再血管化以支持创面闭合和组织再生的新策略。

细胞外基质（extracellular matrix, ECM）来源的生物材料已成为创面愈合的一种有前景的方法。与纯化的单一ECM组分生物材料相比，更接近天然组织ECM谱的复杂生物材料可能更有利于支持细胞相互作用和驱动创面愈合。人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cell, hiPSC）衍生细胞作为一种细胞来源ECM具有独特优势：其胎儿样特性、较低的变异性和较少的伦理问题使其成为有吸引力的ECM来源；其无限扩增能力可用于ECM沉积的规模化生产；已有研究表明hiPSC衍生细胞能够沉积富含胶原蛋白和纤连蛋白等促进血管化和创面愈合成分的ECM。基于此，本研究旨在开发一种由hiPSC衍生血管细胞沉积ECM修饰的促血管生成水凝胶，用于慢性创面的治疗。

二、研究内容与主要结论

研究人员将hiPSC向血管谱系分化，经CD31表达分选获得CD31阳性内皮细胞（iEC）和CD31阴性基质细胞（iSC）两个群体。iSC群体经免疫荧光鉴定表达MYH11、SM-22α和波形蛋白（vimentin）等基质细胞标志物，呈现包含平滑肌细胞、成纤维细胞和周细胞等多种支持性细胞类型的异质性。在抗坏血酸（ascorbic acid, AA）和大分子拥挤剂卡拉胶（carrageenan, C）的联合处理下，iSC培养21天后沉积了富含纤连蛋白、纤维状胶原蛋白、串珠素（perlecan）、糖胺聚糖（glycosaminoglycans, GAGs）和硫酸化糖胺聚糖（sulphated GAGs, sGAGs）的ECM。通过优化的脱细胞方案（结合化学试剂、冻融循环和DNA酶处理），DNA含量显著降低约98.9%，达到避免不良免疫反应的标准。

脱细胞ECM（decellularised ECM, dECM）在二维Matrigel管形成实验中表现出促血管生成能力，可瞬时加速iEC形成管状结构和连接点的进程。研究人员将dECM以0.05 mg/mL和0.5 mg/mL两种浓度掺入丙烯酸酯修饰的透明质酸（AcHyA）水凝胶中，发现dECM的加入不影响水凝胶的凝胶化时间和储能模量，但高浓度dECM增加了水凝胶的杨氏模量。所有水凝胶在水解条件下保持稳定，在透明质酸酶作用下96小时内完全降解，dECM随降解逐渐释放。细胞实验表明，0.5 mg/mL dECM水凝胶显著增强了HUVEC的代谢活性、附着和伸长，也显著提高了人真皮成纤维细胞（hDF）的附着。此外，接种在0.5 mg/mL dECM水凝胶上的hDF条件培养基能够显著增加HUVEC的总分支长度，呈剂量依赖性效应。

三、关键技术与方法

本研究采用了以下主要关键技术方法：hiPSC的血管分化（使用CHIR99021进行中胚层诱导，VEGF进行血管规格化）；磁激活细胞分选（magnetic-activated cell sorting, MACS）基于CD31表达分离iEC和iSC群体；大分子拥挤技术（使用卡拉胶和抗坏血酸促进ECM沉积）；物理-化学-酶联合脱细胞方案（冻融循环、氢氧化铵、Triton X-100和DNA酶处理）；免疫荧光和组织学染色（包括阿尔辛蓝染色、天狼星红染色）表征ECM成分；Matrigel管形成实验评估促血管生成能力；透明质酸的丙烯酸酯化学修饰（AcHyA合成）及PEG-二硫醇交联水凝胶制备；流变学和力学测试评估水凝胶生物物理性能；AlamarBlue代谢活性测定和细胞形态学分析评估生物相容性。iPSC系RCSI-D1来源于一名健康男性供体的外周血单核细胞重编程。

四、研究结果

hiPSC的血管分化：经血管分化方案处理后，hiPSC从典型集落形态逐渐转变为异质性细胞群体，第6天出现广泛但非均匀的CD31表达，表明血管分化成功，产生了包含CD31阳性iEC和CD31阴性iSC的混合群体。

iSC和iEC的表征：iSC群体不表达CD31，但阳性表达MYH11（59.8±12.2%）、SM-22α（25.7±26.4%）和波形蛋白（55.5±27.4%），表明其基质细胞样特性，包含成纤维细胞和平滑肌细胞等支持性细胞类型。iEC阳性表达CD31，并在1至3小时内形成管状结构，证实其内皮细胞功能。

脱细胞效率验证：仅使用化学试剂（氢氧化铵和Triton X-100）处理时DNA浓度降低有限，加入3次冻融循环和DNA酶处理后，DNA浓度从约1461.8 ng/mL显著降至26.5 ng/mL以下，实现约98.9%的DNA去除，DAPI染色进一步证实细胞被有效移除。

ECM成分分析：AA+C处理组产生最高dECM产量。免疫荧光和组织学染色显示iSC沉积的ECM富含纤连蛋白、纤维状胶原蛋白、串珠素、GAGs和sGAGs。脱细胞后纤连蛋白、纤维状胶原蛋白和串珠素保留程度较高，GAGs和sGAGs保留程度相对较低。dECM蛋白含量约为其冻干质量的65%。

dECM促血管生成能力（二维）：在Matrigel管形成实验中，dECM培养基补充瞬时加速了iEC形成管状结构和连接点的进程，尤其是在前2小时内，表明dECM具有促进血管生成和内皮出芽的潜力。

AcHyA水凝胶的生物物理特性：AcHyA、0.05 mg/mL dECM和0.5 mg/mL dECM水凝胶的凝胶化时间分别为7.1±2.3、5.5±1.9和8.9±3.5分钟，无显著差异。储能模量分别为563.4±146、749.4±97.4和643.7±216.4 Pa，无显著差异。杨氏模量分别为1.7±0.3、3.5±0.7和3.3±0.5 kPa，dECM的加入显著增加了水凝胶刚度。所有水凝胶溶胀率约为246%至272%。水解条件下48小时稳定，透明质酸酶处理下96小时完全降解，0.5 mg/mL dECM水凝胶降解最快。蛋白释放呈随dECM浓度增加的趋势但无显著差异。

dECM水凝胶的细胞相容性和促血管生成能力（三维）：0.5 mg/mL dECM水凝胶在7天内显著增强了HUVEC的代谢活性，增加了HUVEC和hDF的细胞附着密度。HUVEC在0.5 mg/mL dECM水凝胶上呈现更伸长的形态，细胞圆度降低。hDF在0.5 mg/mL dECM水凝胶上的附着显著高于其他组。来自0.5 mg/mL dECM水凝胶上hDF的条件培养基显著增加了HUVEC的总分支长度，呈剂量依赖性效应。

五、讨论与结论

讨论部分指出，hiPSC衍生血管细胞来源的ECM含有多种在创面愈合和血管生成中起关键作用的成分。纤连蛋白在损伤后迅速替代纤维蛋白凝块，通过整合素结合位点的呈递刺激内皮细胞出芽和管状结构形成；纤维状胶原蛋白在肌动蛋白细胞骨架组织、内皮细胞存活和结构支持中发挥重要作用；串珠素作为基底膜中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，能够与VEGF和成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）等促血管生成生长因子相互作用并增强其效应；GAGs和sGAGs参与生长因子和细胞因子结合以及血管生成过程中内皮细胞增殖的调控。脱细胞后GAGs的明显减少可能部分反映了细胞膜上GAGs的去除，而细胞外沉积的GAGs得以保留。将dECM掺入基于非硫酸化GAG（HyA）的水凝胶可弥补低GAG沉积的不足。

研究人员还讨论了iSC群体的异质性优势，其包含的多种支持性细胞类型有助于沉积结构支持性ECM成分，促进功能成熟血管结构的形成。大分子拥挤剂卡拉胶通过空间位阻效应减少大分子扩散，加速ECM沉积过程；抗坏血酸作为胶原蛋白羟化反应的辅因子增强胶原沉积。脱细胞方案的优化对于避免不良免疫反应至关重要。dECM在二维和三维环境中均表现出促血管生成能力，且呈剂量依赖性效应。水凝胶中dECM的缓释特性可在创面床中持续刺激周围细胞的促血管生成行为。

研究结论指出，本研究描述了一种有前景的基于HyA的水凝胶用于慢性创面治疗。iSC沉积的ECM含有纤连蛋白、胶原蛋白、串珠素和GAGs等成分。在二维环境中，dECM处理可瞬时加速内皮细胞管状结构的形成。此外，高浓度dECM水凝胶增强了HUVEC和hDF的代谢活性、附着和铺展。研究表明，hiPSC衍生血管细胞来源的ECM与HyA基水凝胶相结合是潜在促进血管生成的有前景策略。未来工作将聚焦于进一步评估dECM的促血管生成能力、深入表征其组成，并最终在临床前创面模型中评估其驱动创面愈合的能力。