短杆菌肽通过抑制ABL-MMP9信号轴阻断肺癌转移的研究

《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Gramicidin Inhibits Lung Cancer Metastasis by Suppressing the ABL-MMP9 Signaling Axis

　　

短杆菌肽（Gramicidin）通过抑制ABL-MMP9信号轴（ABL-MMP9 signaling axis）阻断肺癌转移 摘要：肺癌是全球致死率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占大多数，且因其侵袭性转移特性严重损害治疗效果和总生存率。Abelson酪氨酸激酶（ABL）作为多种肿瘤转移的关键调控因子，已成为有前景的治疗靶点。研究人员采用CCK-8、集落形成、Transwell及划痕愈合实验评估了短杆菌肽对NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭的影响；利用蛋白质印迹法（WB）分析ABL蛋白水平；在ABL敲低细胞中，通过明胶酶谱法、WB、Transwell及划痕愈合实验检测ABL表达对MMP9水平及细胞迁移和侵袭的影响；对ABL过表达细胞施以短杆菌肽处理，通过WB、Transwell及划痕愈合实验观察短杆菌肽对ABL-MMP9轴的抑制作用。在通过尾静脉注射肿瘤细胞建立的BALB/c裸鼠肺转移模型中，研究人员评估了短杆菌肽对体内转移结节形成的抑制效果及其对ABL和MMP9表达的影响。结果表明，短杆菌肽显著抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭；ABL在人肺癌细胞中上调表达，并可被短杆菌肽有效抑制；短杆菌肽通过抑制ABL蛋白表达下调MMP9，从而减弱肺癌转移。在体内实验中，短杆菌肽处理减少了肺部转移结节数量，同时下调肺组织中ABL和MMP9蛋白水平，而ABL过表达可部分逆转这些效应。本研究揭示了短杆菌肽通过抑制ABL-MMP9轴阻断肺癌转移的分子机制，为开发基于短杆菌肽的抗转移策略提供了理论基础。

一、研究背景与目的

肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，2022年全球新发病例约248万，死亡病例约180万。其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌病例的85%，多数患者在确诊时已处于伴有远处转移的晚期阶段。转移是导致肺癌预后不良的关键决定因素，极大增加了治疗复杂性。目前的治疗手段包括靶向治疗、免疫治疗和化疗，均存在固有局限性：针对EGFR/ALK/ROS1驱动基因改变的靶向药物虽对携带相应突变的患者有效，但常难以控制某些转移灶；免疫治疗虽可改善部分患者的长期生存，但应答率仅为20%–30%。因此，阐明肺癌转移的分子机制并开发有效的抗转移策略对于改善患者预后至关重要。

Abelson酪氨酸激酶（ABL）是一种进化保守的非受体酪氨酸激酶，调控增殖、分化、凋亡及细胞骨架重塑等多种细胞功能。ABL最初因在慢性髓系白血病中产生BCR-ABL致癌融合蛋白而被认识，但越来越多的证据表明ABL参与多种实体瘤的转移过程。ABL可通过激活Rho家族GTP酶、重塑F-肌动蛋白细胞骨架、诱导上皮间充质转化（EMT）及上调癌蛋白等方式增强癌细胞侵袭性和远处转移能力。在HER2阳性乳腺癌中，ABL通过激活YB-1增强ERBB2 mRNA翻译驱动脑转移。ABL过表达与NSCLC转移密切相关，且在异种移植模型中，ABL通过TAZ和β-catenin激活驱动转移进展。因此，靶向ABL可能是对抗肺癌转移的有效策略。

短杆菌肽是由短芽孢杆菌产生的线性多肽抗生素，传统用于抗菌目的，其作用机制是通过插入细胞膜形成离子通道，破坏膜通透性并诱导细胞死亡。近期研究揭示了短杆菌肽潜在的抗肿瘤特性，其机制涉及线粒体去极化、细胞周期阻滞和离子稳态破坏。研究人员前期通过分子动力学模拟和虚拟筛选发现短杆菌肽可与四种酪氨酸激酶（包括ABL）高亲和力结合，提示其可作为天然多靶点酪氨酸激酶抑制剂（TKI）用于肺癌治疗。本研究旨在探讨短杆菌肽在肺癌中的抗转移效应及其潜在分子机制。

二、主要技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：CCK-8法测定细胞活力并计算半数抑制浓度（IC₅₀）；集落形成实验评估细胞增殖能力；Transwell小室实验（含Matrigel预涂膜的侵袭实验）检测细胞迁移和侵袭能力；划痕愈合实验监测细胞迁移速率；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测ABL mRNA表达水平；蛋白质印迹法（WB）检测ABL、MMP9和MMP2蛋白表达水平；明胶酶谱法检测MMP9和MMP2酶活性；放线菌酮（CHX）追踪实验评估ABL蛋白稳定性；乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评价细胞膜完整性；建立BALB/c裸鼠尾静脉注射肿瘤细胞的肺转移模型进行体内实验；免疫组织化学（IHC）染色检测Ki-67增殖标志物；苏木精-伊红（HE）染色进行组织学观察；血清生化指标检测（AST、ALT、BUN、Cre）评估肝肾功能毒性。

三、研究结果

3.1 短杆菌肽抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭

CCK-8实验显示，短杆菌肽以剂量依赖性方式降低HCC4006细胞活力，40 nM浓度下细胞活力降至34.32%。以IC₅₀浓度（24.96 nM）处理后，集落形成实验证实短杆菌肽显著抑制细胞增殖能力。Transwell实验表明，短杆菌肽处理组穿过膜的迁移和侵袭细胞数明显少于对照组。划痕愈合实验一致显示短杆菌肽显著降低癌细胞迁移速率。选择性指数（SI）分析表明短杆菌肽对肺癌细胞的IC₅₀远低于对人支气管上皮细胞（HBE）的IC₅₀，显示出良好的选择性细胞毒性。LDH释放实验证实该浓度下短杆菌肽未引起显著的细胞膜损伤。

3.2 ABL在短杆菌肽处理的肺癌细胞中下调

RT-qPCR和WB结果显示，ABL在三种人肺癌细胞系（HCC827、HCC4006、H1650）中的表达水平显著高于正常HBE细胞。选取ABL表达水平最高的HCC4006和H1650细胞进行后续干预实验，24小时短杆菌肽处理使两种细胞系的ABL蛋白水平显著降低。CHX追踪实验显示，在蛋白质合成抑制剂CHX存在下，短杆菌肽处理组与对照组的ABL蛋白降解曲线近乎平行，表明短杆菌肽并不加速ABL蛋白降解，而是主要通过抑制ABL蛋白合成来降低其表达水平。

3.3 ABL通过上调MMP9促进肺癌转移

将对照shRNA（SCR）或ABL1/ABL2 shRNA（AA）转染至HCC4006细胞后，RT-qPCR和WB验证了敲低效率。明胶酶谱法和WB结果显示，AA组中MMP9和MMP2水平显著降低。Transwell实验表明，AA组中具有迁移和侵袭能力的癌细胞数量较SCR组显著减少。划痕愈合实验显示AA组的迁移速率明显降低。上述结果表明，肺癌细胞中的ABL通过上调基质金属蛋白酶（MMPs）驱动癌细胞迁移和侵袭。

3.4 短杆菌肽通过介导ABL-MMP9轴影响肺癌细胞迁移和侵袭

构建ABL过表达（oe-ABL）细胞并进行短杆菌肽处理。WB结果显示，短杆菌肽处理后ABL和MMP9蛋白水平显著降低，而过表达ABL蛋白可显著恢复MMP9水平，表明短杆菌肽对MMP9的抑制作用可被ABL过表达所逆转。Transwell和划痕愈合实验一致显示，短杆菌肽对癌细胞迁移和侵袭的抑制作用也可被ABL过表达所逆转。这表明短杆菌肽的抗转移效应可能通过ABL-MMP9信号轴介导。

3.5 短杆菌肽通过调控ABL-MMP9信号轴抑制小鼠肺癌转移

在BALB/c裸鼠尾静脉注射肿瘤细胞建立的肺转移模型中，短杆菌肽处理组肺部表面转移结节数较对照组显著减少，而ABL过表达可显著逆转这一减少趋势。Ki-67 IHC染色显示，短杆菌肽处理组肺转移灶内Ki-67阳性细胞比例明显低于对照组，表明增殖活性受到抑制，ABL过表达可部分逆转短杆菌肽介导的增殖抑制。体重监测及肝脏损伤标志物（AST、ALT）和肾功能指标（BUN、Cre）检测显示短杆菌肽在该剂量下具有良好的安全性。WB分析显示短杆菌肽处理显著下调肺组织中ABL和MMP9蛋白水平，ABL过表达可大部分恢复MMP9表达。

四、讨论与结论

讨论部分指出，ABL蛋白表达与肺癌转移密切相关，抑制ABL激酶活性已成为克服肺癌转移的关键策略。现有TKI虽在初期表现出疗效，但存在靶点选择性差、易产生耐药等问题，因此开发更高选择性和更强抑制效率的新一代TKI具有重要意义。本研究发现短杆菌肽可直接结合并降低ABL蛋白稳定性，进而抑制MMP9表达，阻断肺癌转移。研究还讨论了MMP9表达的复杂调控网络，包括MAPK/ERK、JNK和PI3K/AKT等通路也可能参与转录调控MMP9，但通过遗传学操作（特异性敲低和过表达ABL）证实ABL是该调控网络中的主导节点。此外，短杆菌肽还可能靶向ALK、TRK和MET等其他酪氨酸激酶，但ABL-MMP9通路是介导抗转移表型的主要途径。研究也指出了短杆菌肽作为离子载体的膜穿孔风险及毒性的限制，建议通过结构衍生化或纳米载体递送系统来促进其临床应用。

研究结论：本研究全面阐明了短杆菌肽在肺癌中的抗转移效应及其作用机制，证明短杆菌肽通过阻断ABL-MMP9轴有效抑制肺癌转移。这些发现为开发基于短杆菌肽的抗肺癌转移策略奠定了重要基础。